RhoA/ROCK信號通路在左心疾病致大鼠肺動脈高壓模型中的作用

吳進福，周曉慧，范慧敏，，林芳，寶璐爾，張林，姜麗華*，劉中民，*

（1.鄭州大學第三附屬醫院麻醉科，鄭州 450052；2.上海市心力衰竭研究中心，上海 200120；3.同濟東方轉化醫學研究中心，上海 200120；4.同濟大學附屬東方醫院心外科，上海 200120)

研究報告

RhoA/ROCK信號通路在左心疾病致大鼠肺動脈高壓模型中的作用

吳進福1，周曉慧2，3，范慧敏2，3，4，林芳2，3，寶璐爾4，張林2，3，姜麗華1*，劉中民2，3，4*

（1.鄭州大學第三附屬醫院麻醉科，鄭州 450052；2.上海市心力衰竭研究中心，上海 200120；3.同濟東方轉化醫學研究中心，上海 200120；4.同濟大學附屬東方醫院心外科，上海 200120)

目的探討RhoA/ROCK信號通路在左心疾病相關的大鼠肺動脈高壓模型中的表達水平和作用。方法3～4周齡雄性SD大鼠20只，體重90～100 g，隨機分為對照組（C組:n=10)、肺高壓組（H組:n=10)。H組采用升主動脈固定縮窄術建造左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型，C組大鼠行假手術處理（鈦夾固定于血管旁縱隔組織而非升主動脈，其他所有手術操作同H組)，在建模后60 d，對各組大鼠進行血流動力學（右心室收縮壓、肺動脈壓力)檢測，處死大鼠并用PBS行在體心肺灌洗致雙肺變白，左肺組織固定于4%多聚甲醛行病理切片以觀察肺組織病理形態學變化、右肺組織凍存以備生物分子學檢測（Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA)。結果與C組相比，H組肺動脈壓力、右心室收縮壓明顯增高（P＜0.01)，肺小動脈壁明顯增厚，肺小動脈管腔狹窄甚至閉塞，管壁肥厚指數明顯增大（P＜0.01)；與C組相比，H組肺組織的Rho激酶mRNA表達水平明顯增加，RhoA mRNA、ET-A受體mRNA表達水平亦明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.01)。結論采用升主動脈固定縮窄術成功建造了左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型；與C組相比，H組肺小血管壁明顯增厚，肺組織的Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA表達明顯增高，該信號通路可能參與了左心疾病相關肺動脈高壓的形成過程。

肺動脈高壓；升主動脈縮窄；Rho激酶；RhoA；大鼠

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH)是由多種病因導致的一種極度嚴重的疾病，以肺血管阻力進行性加重為其臨床特征，是死亡率較高的一種慢性消耗性疾病[1］，其發病機制尚未完全闡明。已有研究表明，RhoA/ROCK信號通路的異常激活與肺血管內皮功能受損、肺血管收縮性增強以及肺血管壁結構重組等病理生理過程密切相關，在肺動脈高壓發病機制中扮演重要角色[2］。RhoA/ROCK信號通路異常激活在肺動脈高壓發生發展過程中所起的作用在多種肺動脈高壓的動物模型中已經得到證明，如:丹佛海拔高度下誘導的fawn-hooded大鼠PH模型[3］、慢性低氧環境誘導的大鼠PH模型[4，5］、野百合堿誘導的大鼠PH模型[6］、血管內皮生長因子受體阻滯劑誘導的大鼠PH模型[7］等。然而，左心功能異常（收縮功能障礙、舒張功能障礙、心臟瓣膜病)是引發肺動脈高壓的重要病因之一[8］，RhoA/ ROCK信號通路的異常激活在左心疾病相關性PH中的作用卻鮮有研究。另外，RhoA/ROCK信號通路與血管活性物質內皮素（ET-1)之間存在相互調節關系，抑制ROCK對心臟所起到的保護作用與間接下調ET-1的表達有關[9］，而其在左心疾病相關性PH中是否有相似作用，尚不得而知。本研究擬通過升主動脈縮窄致大鼠肺動脈高壓的模型，來探討RhoA/ROCK信號通路在左心疾病致大鼠肺高壓中的表達水平和作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SPF級SD大鼠20只，3～4周齡，體重90～100 g，由上海市實驗動物中心提供【SCXK（滬) 2013-0016】，實驗在同濟大學實驗動物中心進行【SYXK（滬)2009-0022】。隨機分為2組:對照組（C組:n=10)、左心疾病相關肺高壓組（H組:n= 10)。

1.2 模型制備

本研究采用冠狀動脈開口以上的升主動脈縮窄手術來建造左心疾病相關大鼠肺動脈高壓模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（CAS No:57-33-0，美國Sigma)對實驗大鼠進行麻醉（用量:5 mL/100 g)，用20G靜脈留置針軟管（批號:1200843，中國競瑪)對麻醉后大鼠行經口氣管插管術，接小動物呼吸機（產品型號:ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司，參數設置:潮氣量4～5 mL，頻率70～80次/分)，在胸部正中與前肢平行處行2～3 cm切口，鈍性分離皮下肌肉組織充分暴露胸骨及氣管，正中劈開胸骨1～2 cm，沿氣管左側向下逐漸鈍性分離各組織，可去掉部分有礙術野的胸腺組織，充分暴露主動脈弓，迅速環繞升主動脈植入一個事先依據大鼠體重設定好內徑（0.8 mm)的鈦夾（產品標準號: YZB/國1931-2011，建德市康華醫療器械有限公司)以縮窄升主動脈的口徑，在確認沒有明顯出血后于吸氣末閉合胸腔，無菌外科逐層縫合切口，手術結束后各模型鼠單籠SPF級別飼養。對照組大鼠行假手術處理，即開胸分離升主動脈后，鈦夾固定于周圍縱隔組織而非升主動脈，其他操作同模型組。各組大鼠于手術操作60 d后行血流動力學檢測及處死取材以備各指標的檢測[10］。

1.3 血流動力學檢測

在造模后第60天，對各組大鼠行血流動力學監測:腹腔注射1%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉（用量:5 mL/100 g)，連接心電圖電極，行心電監護，用75%的乙醇對大鼠頸部進行消毒，小心分離大鼠右頸外靜脈，從右頸外靜脈插入肝素化的聚乙烯測壓管，測壓管另一端連接換能器（保證換能器與心臟位置同高)，由多導生理記錄裝置（Power Lab 8/30；AD Instruments，Sydney，Australia)進行檢測記錄，根據顯示器波形變化判定測壓管位置，先測定大鼠右心室收縮壓，波形穩定后調整測壓管位置，直至測壓管進入肺動脈，待波形穩定，保存檢測結果，分析波形，計算各組壓力值（本步測壓、分析波形、計算數據由上海市肺科醫院肺循環實驗室提供技術)。

1.4 病理學檢查

各組大鼠用15 mL PBS液進行心肺灌洗，去除心肺組織內的血液，整體取下大鼠心肺組織，然后，新鮮左肺浸入4%多聚甲醛固定液中固定，固定時間至少72 h，之后制成蠟塊并切片，用于HE染色行病理學檢查，使用Image-Pro Plus 6.0對肺小動脈的直徑及管壁進行測量，從而計算小動脈中層增厚的程度。

1.5 m RNA檢測

（右肺組織行Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA表達的檢測)右肺組織置于無菌凍存管，液氮速凍之后于 -80℃凍存用于QPCR檢測。引物由上海英濰基貿易有限公司合成，Rho激酶mRNA引物品號 A12925:上游序列為5’-CTGCGGGTACGAAGGTATCG-3’，下游序列為5’-AGCATCCAATCCATCCAGCA-3’；RhoA mRNA引物品號A12925:上游序列為5’-ACCAGTTCCCAGAGGTGTATG-3’，下游序列為5’-TTGGGACAGAAGTGCTTGACTTC-3’；ET-A受體mRNA引物品號A12925:上游序列為5’-CCGAGGAGCTCTAAGGGGAA-3’，下游序列為5’-CCAAAAGGACGCCAGAAAGC-3’；GAPDH引物品號 A12926:上游序列 5’-GCCATCAACGACCCCTTCATTG-3’，下游序列 5’-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3’；根據 TRNzol-A+總RNA提取試劑盒（目錄號:66020，美國Ambion?)說明書的步驟進行大鼠肺組織總RNA提??；根據逆轉錄試劑盒（貨號:AK2702，日本TaKaRa)說明書的步驟進行RNA反轉錄；根據Power SYBR? Green PCR Master Mix（貨號:1407463，英國Applied Biosystems?)說明書步驟進行QPCR操作；測定樣本mRNA的表達量。

1.6 統計學處理

本研究所得數據用SPSS 15.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 右心室收縮壓、肺動脈壓檢測結果

經右頸外靜脈插入肝素化的聚乙烯測壓管至右心室、肺動脈，測壓管另一端連接換能器，由多導生理記錄裝置進行檢測記錄，結果顯示，H組與C組相比，平均肺動脈壓、右心室收縮壓均顯著升高，P＜0.01（表1所示)。結果證明，利用升主動脈固定縮窄術成功建造大鼠肺動脈高壓模型。

表1 兩組血流動力學的比較（±s，mmHg，n=10) Tab.1 Hemodynamics of the two groups

表1 兩組血流動力學的比較（±s，mmHg，n=10) Tab.1 Hemodynamics of the two groups

注:與C組相比，**P＜0.01。Note.**P＜0.01，Compared with the group C.

右心室收縮壓Right ventricular systolic pressure C組Group C 17.2073±1.7406 27.1510±3.0432 H組Group H 33.0659±4.4519**58.8399±7.3327**組別Groups平均肺動脈壓Mean pulmonary artery pressure

2.2 肺組織病理學改變

經多聚甲醛固定后的大鼠肺組織進行石蠟包埋、切片、HE染色，染色后的切片使用軟件Image-Pro Plus 6.0對肺小動脈的直徑及管壁進行測量，從而計算并比較小動脈中層增厚的程度（肺小動脈管壁與血管直徑的比值)，結果顯示，與C組（0.1655 ±0.03633)相比，H組（0.3864±0.06659)小動脈中層明顯增厚，P＜0.01（圖1所示)。圖1A、B分別顯示HE染色的C組和H組肺組織，圖1C為C組和H組肺小動脈中層厚度與肺小動脈直徑比值的統計學結果。

2.3 肺組織Rho激酶mRNA、RhoA m RNA、ET-A受體mRNA表達的檢測結果

RT-PCR測Rho激酶mRNA、RhoAmRNA、ET-A受體mRNA水平的表達:以GAPDH為內參對照，結果以Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA與GAPDH mRNA的2-△△CT表示其相對表達量。結果顯示，H組與C組相比，Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA的相對表達量均明顯增高，P＜0.01（表2所示)。

圖1 肺組織病理改變Fig.1 Morphometric analysis of the pulmonary arteries

表2 兩組Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA相對表達量的比較（±s，n=10)Tab.2 mRNA levels of Rho kinase，RhoA and ET-AR in lungs of the two groups

表2 兩組Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA相對表達量的比較（±s，n=10)Tab.2 mRNA levels of Rho kinase，RhoA and ET-AR in lungs of the two groups

注:與C組相比，**P＜0.01。Note.**P＜0.01，compared with the group C.

ET-A受體mRNA相對表達量ET-AR mRNA levels C組Group C 1.0140±0.1377 0.9667±0.1412 1.0040±0.08159組別Groups Rho激酶mRNA相對表達量mRNA levels of Rho kinase RhoA mRNA相對表達量RhoA mRNA levels H組Group H 17.9391±1.2489**38.4689±3.0000**2.3926±0.2775**

3 討論

依據病理表現、血流動力學特征以及臨床診治策略肺動脈高壓分五大類:①動脈性肺動脈高壓；②左心疾病所致肺動脈高壓；③缺氧和/或肺部疾病引起的肺動脈高壓；④慢性血栓栓塞性肺動脈高壓；⑤多種機制和/或不明機制引起的肺動脈高壓[11］。其中，作為第二大類肺高壓的左心疾病所致的肺高壓在臨床上比單純的動脈型肺動脈高壓還要多見，并且這種病患群體的發病率和死亡率日益增加[12］。目前，常規治療肺動脈高壓的藥物在左心疾病相關性PH治療中的作用差強人意，因此，進一步探究本病的發病機制、探索新的治療靶點十分必要。前期大量研究已表明，RhoA/ROCK信號通路異常激活在多種肺動脈高壓大鼠模型中均起到至關重要的作用[3-7］，該信號通路在左心疾病所致肺動脈高壓的發生過程中是否發揮相似作用，仍需進一步的研究。

采用金屬鈦夾將大鼠升主動脈進行固定縮窄，以增加左心室后負荷，進而導致左心室壓力增高、心室壁代償肥大，久之會進一步發展為肺動脈高壓，符合左心疾病相關肺動脈高壓病人的病理發展過程，許多研究已證明了此建模方法的可行性[9，13-15］。本研究中我們采用金屬鈦夾縮窄大鼠升主動脈建立大鼠PH模型，并于建模后60 d比較C組與H組之間右心室收縮壓及肺動脈壓的差異，結果顯示，該方法可成功建造大鼠肺動脈高壓模型，血流動力學結果和病理學結果顯示采用升主動脈縮窄術建造的大鼠肺動脈高壓模型，與人類左心疾病所致肺動脈高壓的病理生理狀態相似，與文獻報道一致。

ROCK（即Rho激酶)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶類家族，是小GTP結合蛋白RhoA一個重要的下游信號蛋白[16］。G蛋白偶聯受體被激動因子（如ET-1、5-HT等)可通過 ET受體活化 RhoA進而激活ROCK，活化的ROCK可使平滑肌細胞內肌球蛋白輕鏈磷酸化酶（MLCP)的一個亞基—MYPT-1發生磷酸化，進而使MLCP失活、胞內磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC)水平增高，介導非Ca2+濃度依賴性的平滑肌細胞收縮；另一方面，活化的ROCK可激活細胞膜Ca2+通道增加Ca2+內流，胞內Ca2+濃度增加從而激活肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK)，活化的ML-CK促使MLC磷酸化，胞內p-MLC水平增高，介導Ca2+濃度依賴性的平滑肌細胞收縮；同時，ROCK可促進平滑肌細胞的分化、增生與移行，并參與調節內皮細胞移行和血管內皮屏障功能[17-19］。RhoA/ ROCK信號通路通過多條途徑影響血管平滑肌的收縮，從而在PH的發生發展過程中起到關鍵作用。但有關該信號通路在左心疾病相關肺高壓中的研究較少，本研究中，我們發現，與對照組相比，肺動脈高壓組Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA的表達水平顯著升高，提示RhoA/ROCK信號通路的異常激活在此類肺高壓模型中亦起到了至關重要的作用，且此信號通路的活化可能與ET-1分子表達量增高有關。另外，病理組織切片結果顯示，肺動脈高壓時存在肺小動脈血管重構的改變，此現象可能與RhoA/ROCK信號通路的異常激活有關，該結果為進一步在左心疾病所致肺高壓中研究RhoA/ ROCK信號通路在肺微血管病變中的作用機制提供了部分實驗數據。

因此，本研究的結果表明，通過縮窄升主動脈可成功建立大鼠肺動脈高壓模型；在大鼠左心疾病所致的肺高壓的發生模型中，Rho激酶mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA的表達水平明顯升高，提示RhoA/ROCK信號通路異常激活（可能與ET-1因子表達量增高有關)，進而可能參與肺小動脈的血管重構，有關RhoA/ROCK信號通路如何介導左心疾病相關肺高壓的發展過程，以及如何阻斷該信號通路進而改善左心疾病相關肺高壓的作用仍需進一步的研究。

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The role of RhoA/ROCK pathwaj in the ratmodels of left heart disease-associated pulmonarj hjpertension

WU Jin-fu1，ZHOU Xiao-hui2，3，FAN Hui-min2，3，4，LIN Fang2，3，BAO Lu-er4，ZHANG Lin2，3，JIANG Li-hua1*，LIU Zhong-min2，3，4*
（1.Department of Anesthesiology，the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2.Shanghai Heart Failure Research Center；3.Research Center for Translational Medicine；4.Department of Cardiac Surgery，Shanghai East Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai200120)

ObjectiveTo investigate the role of RhoA/Rho-kinase pathway in ratmodels of left heart disease-associated pulmonary hypertension（PH-LHD).MethodsTwentymale SD rats（3-4 week-old，90-100 g)were randomly divided into two groups（10 rats in each group):the group C（control group)with sham operation，and group H（pulmonary arterial hypertension).The ratmodel of leftheartdisease-associated pulmonary hypertension was established by supracoronary aortic banding in the group H，and the sham surgerywas applied for the rats in the group C（The titanium clip wasfixed at themediastinal tissue adjacent to the artery rather than the ascending aorta).On day 60 after the operation，the cardiac functions，including rightventricular systolic pressure and pulmonary artery pressurewere evaluated.After that，all rats were sacrificed and treated with cardiopulmonary lavage in vivo until the lung became white.Then the left lung tissues were fixed in 4%paraformaldehyde for pathological observation while the right lung tissues were frozen formRNA detection.ResultsCompared with the group C，both ventricular systolic pressure and pulmonary artery pressure in the group H were increased significantly（P＜0.01).Pathological data demonstrated that the pulmonary artery walls in H group were much thicker than that in the group C.Moreover，vascular wall hypertrophy index in the group H was increased greatly compared with that in the group C（P＜0.01).QPCR data showed thatmRNA levels of Rho kinase，RhoA and ET-A R in the group H were up-regulated compared with the group C（P＜0.01).ConclusionsRatmodelof leftheartdisease-associated pulmonary arterial hypertension can be successfully established by supracoronary aortic banding.Rho-kinase-mediated pathwaymay contribute to the pathogenesis and progress of leftheart disease-associated pulmonary arterial hypertension.

Pulmonary arterial hypertension；Supracoronary aortic banding；Rho kinase；RhoA；Rat

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0612-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.013

2015-07-07

科技部國際合作項目（2012DFG31440)；上海市科委（13411951402)；上海市領軍人才（2012053)；上海市浦東新區國際合作項目（Pkj2013-z03)。

吳進福（1988-)，男，碩士研究生，專業:麻醉學。

姜麗華（1963-)，女，教授，碩士研究生導師，主要研究方向:圍術期器官保護。Email:geda66@126.com；劉中民，1965-，男，教授，博士生導師，主要研究方向:心力衰竭。Email:zhongmin_liu@sina.com，