小鼠臍帶間充質干細胞的體外誘導分化

朱慧，葉莉，何潔，余璞，2，王金祥，王強，趙晶，龐榮清*，白杰英

（1.成都軍區昆明總醫院云南省干細胞工程實驗室，昆明 650032；2.昆明醫科大學昆明總醫院臨床學院，昆明 650032；3.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

研究報告

小鼠臍帶間充質干細胞的體外誘導分化

朱慧1，2Δ，葉莉3Δ，何潔1，余璞1，2，王金祥1，王強1，趙晶1，龐榮清1*，白杰英3*

（1.成都軍區昆明總醫院云南省干細胞工程實驗室，昆明 650032；2.昆明醫科大學昆明總醫院臨床學院，昆明 650032；3.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

目的分離擴增小鼠臍帶間充質干細胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells，mUCMSCs)探討其是否可誘導成軟骨、脂肪和成骨細胞。方法通過貼壁培養法將mUCMSCs體外分離、擴增、純化，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態特征，運用流式細胞儀檢測分析細胞的抗原標志表達進行鑒定。運用誘導培養液對分離的mUCMSCs分別定向誘導培養為軟骨、脂肪和成骨細胞。結果運用組織貼塊培養法可從新鮮臍帶中分離到貼壁生長的成纖維樣細胞，這些細胞高表達CD29、CD90和CD105，低表達CD34。成軟骨誘導后阿新蘭染色呈藍色；成脂誘導后油紅O染色，出現紅色脂滴；茜紅素染色成骨誘導的mUCMSC，可見紅色結節。結論貼壁培養法分離培養所獲得的mUCMSCs在體外可誘導分化為軟骨、脂肪和成骨細胞。

小鼠；臍帶間充質干細胞；細胞培養；成軟骨誘導；成脂誘導；成骨誘導

隨著干細胞生物學研究不斷發展，分離間充質干細胞用于干細胞治療疾病動物模型和干細胞自身或誘導為體外細胞模型成為生物療法、新藥研發等應用領域的兩個重要發展方向。小鼠是常用的實驗動物，分離小鼠間充質干細胞是開展干細胞誘導分化、干細胞治療實驗、干細胞模型研究的前提條件，是拓展小鼠作為實驗動物在醫學研究中廣泛應用的有效手段。間充質干細胞最早從骨髓[1］分離獲取，目前較受研究者關注，但骨髓來源的間充質干細胞活性容易受到供體年齡的限制[2］，而且骨髓采集數量有限。小鼠骨髓分離間充質干細胞更是如此，一方面其體型小，骨髓數量非常有限，另一方面從小鼠骨髓擴增出間充質干細胞本身就存在一系列困難[3］。我們前期研究發現臍帶是間充質干細胞的一個重要來源，本實驗首次分離鑒定了小鼠臍帶間充質干細胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells，mUCMSC)并開展了體外誘導分化實驗，豐富了小鼠間充質干細胞的來源，為以小鼠作為實驗動物開展再生醫學和干細胞藥物篩選研究提供了技術方法和重要的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6雌性小鼠，每次取材1～2只，8周齡，懷孕14～15 d，體重25～27 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供【SCXK（滇)2013-0001】，飼養并取材于昆明總醫院動物實驗中心【SYXK（滇)2014-0010】。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，按3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養液、胎牛血清和trypsin-EDTA均購自Invitrogen公司；青-鏈霉素溶液購自Biological Industries。細胞增值分析溶液（CellTiter 96? A-queous One Solution Reagent Cell Proliferation Assay)購自Promega公司；FITC標記的抗小鼠流式單抗CD29、CD34和PE標記的CD105均購自eBioscience公司，APC標記的CD90購自R&D公司。儀器主要有二氧化碳培養箱（Healforce)、顯微鏡（Nikon)、酶標儀（Rayto)和流式細胞儀（BD)。

1.3 實驗方法

1.3.1 mUCMSCs的分離與培養

取懷孕16～17 d的C57BL/6小鼠，采用脫頸處死法處死，將串珠狀子宮浸泡于1%雙抗液中帶入細胞室超凈工作臺，無菌采集臍帶一根或數根混合一起，生理鹽水清洗兩遍后，置于1.5 mL離心管，用剪刀剪碎成糊狀，加入含10%FBS的DMEM/F12培養液（500μL)懸浮組織和細胞，轉移至底面積為25 cm2的培養瓶后放入37℃、5%CO2培養箱中靜置培養，注意盡量使組織碎片和細胞均勻鋪于瓶底。顯微鏡下觀察細胞生長特性及形態特征，培養24 h后可見貼壁細胞，補足全量培養液，72 h全量換液。以后每2～4 d換液，待細胞生長至90%以上融合狀態時，用0.25%的trypsin-EDTA消化傳代。

1.3.2 mUCMSCs的生長曲線

消化收集第4代細胞，計數后用10%FBS培養液調整細胞濃度為2×104個/mL，取100μL/孔接種于96孔培養板除四周邊緣之外的孔，每孔設置9個復孔。第3天和第7天全部細胞換液。接種后24 h開始，每天同一時間點取一組復孔換液后加入細胞增殖分析液200μL，加液后3 h用酶標儀測490 nm處吸光度值，連續測試8 d之內細胞增殖情況。取各時間點吸光度的平均值，以時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.3.3 回顧性隊列研究的方法和內容 （1）自基線調查以來心腦血管疾病事件的發生情況：采取從醫保中心獲取數據的方法，回顧性地對隊列人群進行調查，收集10年觀察期內研究對象發生心腦血管疾病事件的相關資料，包括發生的時間、地點、就診醫院、診斷、治療和醫療費等信息。（2）隨訪結局定義：定義為發生結局事件，結局事件包括冠心病事件及腦卒中事件。

1.3.3 mUCMSCs表面標志測定

消化收集第4代細胞，調整細胞濃度至5×105個/mL，取1 mL細胞分別加入單克隆抗體CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-APC、CD105-PE充分混勻，避光室溫孵育30 min，加入PBS離心（1500 r/min，4 min)漂洗棄除未結合抗體后，流式細胞儀檢測細胞表面抗原標志的表達。

1.3.4 mUCMSCs成軟骨誘導分化

收集第4代mUCMSCs并調整細胞懸液為1.6 ×107個/mL，每孔加5μL到12孔板的中心，形成一個細胞滴，2 h后再緩慢加入成軟骨誘導分化培養液，2～3 d換液一次。連續培養14 d后，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋作病理切片，脫蠟后加入阿新藍染色。

1.3.5 mUCMSCs向脂肪細胞誘導分化

消化收集第4代mUCMSCs以4×104個/孔接種細胞于12孔板中培養6 h后，更換培養液為間充質干細胞成脂誘導分化培養基A液，3 d后吸走A液，加入B液，24 h后換回A液，A、B兩液交替左右4次，繼續用B液培養，連續培養至第14天，4%多聚甲醛固定后加入油紅O染色。

1.3.6 mUCMSCs成骨細胞誘導分化

消化收集第4代mUCMSCs以4×104個/孔接種細胞于12孔板中培養6 h后，更換培養液為成骨誘導分化培養液，3～4 d換液1次，培養21 d后，固定并加入茜素紅染色。

2 結果

原代細胞:從1只健康臨產的C57BL/6小鼠，一次可獲得約1 cm長的臍帶約10根，剪碎后貼壁法靜置培養24 h以后，即可在倒置顯微鏡下觀察到少許梭形貼壁細胞由組織塊邊緣或以散在的方式長出（見圖1A)，48 h后貼壁細胞增多（見圖1B)，72 h后可見少數細胞集落形成（見圖1C)，第7～10天可見細胞生長至80%融合狀態。

傳代細胞:原代細胞培養至第10天左右可第一次傳代，之后每3～5 d傳代1次，傳代后細胞生長較快，鏡下可見這些細胞形態較為均一，呈梭形如成纖維細胞樣，密集排列呈現漩渦狀生長（見圖1D)。傳代時消化接種后30 min即有細胞貼壁，此時細胞仍為圓形，1.5 h可見較多細胞貼壁且已變為梭形，3 h左右貼壁細胞達70%以上。

單獨將一根臍帶剪碎后用上述方法培養，也可分離到貼壁生長的成纖維細胞樣細胞，只是不太容易分離成功，常見到原代細胞較少或死亡，且生長速度較慢，但細胞數量較多后細胞增殖速度明顯加快，傳代后生長速度較快。

圖1 C57BL/6UCMSC在光鏡下的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of themUCMSC

圖2 P4 mUCMSC的生長曲線Fig.2 The growth curve of P4 mUCMSC

2.2 m UCMSCs生長曲線

mUCMSCs傳代后，經過6～8 d的增殖生長，完成一個細胞傳代周期，但細胞傳代后不是勻速生長，表現出明顯的階段性，第1～2天細胞增殖緩慢，從第3天開始快速增殖生長，至第5天達到頂點，以后進入相對穩定狀態，體現了細胞潛伏期、快速增殖期和平穩期三個典型的細胞增殖生長階段。

2.3 抗原標志測定

收集生長良好的第4代mUCMSC，加入CD29、CD34、CD90、CD105流式單抗孵育后上機檢測，細胞流式抗原標志結果顯示:CD34低表達，而CD29、CD90、CD105高表達（見圖3)，即表達了間充質干細胞的常見抗原標志，低表達造血干細胞常見抗原標志。

圖3 mUCMSC的免疫表型分析Fig.3 Immunophenotype analysis of the cUCMSC

2.4 成軟骨誘導分化

第4代mUCMSCs經成軟骨分化誘導培養，不斷培養細胞會形成一個細胞團漂浮起來，14 d后，對軟骨球固定并行石蠟包埋切片，阿新蘭染色后可在光鏡下觀察到部分組織呈藍色（見圖4A)。

2.5 成脂誘導分化

第4代mUCMSCs成脂分化誘導培養6 d左右，鏡下可觀察到大量脂滴的出現，A、B液交替后，用B液繼續培養細胞內脂滴逐漸變大變圓，14 d后行油紅O染色，鏡下可見脂滴被染成橙紅色（見圖4B)。

2.6 成骨誘導分化

第4代mUCMSCs成骨分化誘導培養21 d后，可觀察到白色結節，行茜素紅染色后，可觀察到鈣質結節被染成紅色（見圖4C)。

圖4 mUCMSC的體外誘導分化Fig.4 Results of induction culture in vitro for differentiation of themUCMSC

3 討論

本研究結果表明:1次可以從1只C57BL/6小鼠獲得約10根臍帶，剪碎后在10%FBS的DMEM/ F12培養條件下可以分離到大量貼壁，呈漩渦狀生長的成纖維細胞樣細胞，細胞生長呈現潛伏期、快速增殖期和平穩期3個典型的生長階段。流式分析結果顯示這些細胞高表達CD29、CD90、CD105，低表達CD34，在體外誘導分化條件下培養一定時間后可以分別分化為阿新蘭染色陽性的軟骨細胞、油紅O染色陽性的脂肪細胞以及茜素紅染色陽性的骨細胞，這些結果與李建國[3］、Song等[4］報道的骨髓來源間充質干細胞類似。根據間充質干細胞的鑒定標準[5］，可以判定這些細胞就是mUCMSC。實驗中我們還發現:采集1根小鼠臍帶，也可分離到mUCMSC，但成功率較低，而將1只孕鼠所有臍帶混合并剪碎后再直接貼壁培養，可以很容易擴增獲得大量mUCMSC。這應該與細胞密度的影響有關，細胞數量越多，細胞自分泌的生長因子越多，越有利于細胞增殖生長。細胞生長曲線顯示:第4代mUCMSC經過6～8 d即完成一個擴增周期，從第3天開始加速生長，至第5天進入飽和穩定狀態，3 d時間內細胞得到快速擴增，比骨髓來源間充質干細胞生長周期要快[6］，表明mUCMSC增殖活性較好。

臍帶由兩條動脈、一條靜脈和大量沃頓膠（Wharton jelly)組成，后者被認為是間充質干細胞的主要來源。因此，從臍帶分離間充質干細胞通常要剔除血管和外膜[7］。C57BL/6小鼠臍帶長約1 cm，非常柔軟嬌嫩，幾乎不太可能剔除血管和外膜組織。本研究建立的方法可以從C57BL/6小鼠、人[8］、食蟹猴[9］臍帶中輕易分離到 CD29、CD90和CD105陽性率高于95%的間充質干細胞，表明血管和外膜組織的存在不影響間充質干細胞的分離，通過傳代培養可以達到純化間充質干細胞的目的。1只臨產的C57BL/6母鼠可以提供約10根臍帶（約0.3 cm3的組織塊)，有效解決了組織來源困難的問題，而且，臍帶含有陽性表達Oct-4、Nanog等標志的多潛能干細胞[10］，它們具有比成體組織來源干細胞更強的增殖活性和分化潛能[11］。可見，從小鼠臍帶中分離擴增間充質干細胞，效率更高，品質更好。

本實驗建立的分離培養方法，容易規模化生產，可以建立mUCMSC庫，專供以小鼠為背景的科技工作者開展相關研究。主要包括:（1)作為種子細胞開展干細胞治療實驗。比如以C57BL/6小鼠構建的mdx小鼠是肌營養不良研究的常用模型[12］，開展mUCMSC治療mdx小鼠實驗可以探索臨床治療肌營養不良病人的技術方法。（2)作為細胞模型開展藥理或毒理實驗。以細胞模型開展藥物安全及藥物篩選試驗是現代生物醫學研究常用的實驗手段，由于干細胞具有多向分化潛能等獨特的生物學特性[13］，使用 mUCMSC與藥物共培養實驗代替C57BL/6小鼠體內實驗，可以直接在細胞水平進行藥物篩選、毒理機制研究[14，15］，具有高效率、低成本、高敏感性等特點。（3)分化機制研究。機體組織器官功能的形成是干細胞分化演變的結果，干細胞分化是干細胞治療的理論基礎。分化機制研究是尋找疾病治療靶點的重要手段，比如，本實驗已經證明3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素和吲哚美辛等成分與mUCMSC共培養一定時間即可將其誘導為軟骨細胞，如果進一步深入研究這些成分對mUCMSC的影響，就可能發現這些制劑用于軟骨相關疾病治療的作用機制和發病機制。因此，本實驗研究結果具有一定的理論意義和潛在的使用價值。

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Isolation and differentiation in vitro ofmouse umbilical cord mesenchjmal stem cells

ZHU Hui1，2，YE Li3，HE Jie1，YU Pu1，2，WANG Jin-xiang1，WANG Qiang1，ZHAO Jing1，PANG Rong-qing1*，BAIJie-ying3*
（1.Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine，PLA Kunming General Hospital of Chengdu Military Region，Kunming 650032，China；2.Kunming Medical University Clinical College in Kunming General Hospital Kunming 650032；3.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071)

ObjectiveTo isolate，culture and identifymouse umbilical cord mesenchymal stem cells（mUCMSCs) and to study whether they can be induced to differentiate into adipocytes，chondrocytes and osteoblasts.M ethodsThe mUCMSCswere isolated and expanded by adherent culture from freshmouse umbilical cord.Themorphological characteristics of the resulting cellswere observed under inverted phase contrastmicroscope，and their expression ofmesenchymal surfacemarkers was identified and analyzed by flow cytometry.Then mUCMSCs were induced to differentiate into chondrocytes，adipocytes and osteoblasts in vitro.ResultsFibroblast-like cells could be isolated from the fresh umbilical cord by adherent culture.These adherent cells highly expressed mesenchymalmarkers including CD29，CD90 and CD105 while low expression of CD34.The cells were successfully induced to differentiate into chondrocytes，adipocytes and osteoblasts.ConclusionsThemUCMSCs isolated from freshmouse umbilical cord by adherent culture have potential of differentiation into chondrocytes，adipocytes and osteoblasts.

Mouse；Umbilical cord mesenchymal stem cells；Cell culture；Chondrocytes induction；Adipocytes induction；Osteoblast induction

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0622-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.015

2015-06-02

云南省基金項目（2011HB050，2013DA004)；十二五重大項目（2011ZXJ09201-031)；國家自然科學基金（31272385)；北京市自然科學基金（5152023)。

朱慧（1982-)，女，碩士研究生，研究方向為干細胞工程，E-mail:839589513@qq.com；葉莉（1988-)女，實習研究員.研究方向為人獸共患病疾病模型，E-mail:18066045532@163.com。Δ為本研究的共同第一作者。

龐榮清（1971-)，男，副主任醫師/副教授，碩士研究生導師，研究方向為干細胞與再生醫學，E-mail:pangrq2000@aliyun.com；

白杰英（1977-)男，副研究員，研究方向為人獸共患感染性疾病致病機理，E-mail:baijieying@126.com.