eNOS/NO途徑在單側輸尿管梗阻小鼠腎間質微血管病變中的作用與機制

陳雁，牛潼，白海濤，楊曉晶，張燕林，羊欽裕

（1.廈門大學附屬第一醫院兒科，廈門 361003；2.吉林大學基礎醫學院，長春 130000 3.廈門大學附屬第一醫院腎內科，廈門 361003；4.四川綿陽中心醫院兒科，四川綿陽 621099）

研究報告

eNOS/NO途徑在單側輸尿管梗阻小鼠腎間質微血管病變中的作用與機制

陳雁1Δ，牛潼2Δ，白海濤1*，楊曉晶1，張燕林3，羊欽裕4

（1.廈門大學附屬第一醫院兒科，廈門 361003；2.吉林大學基礎醫學院，長春 130000 3.廈門大學附屬第一醫院腎內科，廈門 361003；4.四川綿陽中心醫院兒科，四川綿陽 621099）

目的探討內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎間質纖維化小鼠微血管病變中的作用及機制。方法

內皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；腎小管周圍微血管；內皮祖細胞；血管生長因子；小鼠

多種進展性腎病存在腎小管周圍微血管（peritubular capillaries，PTC）病變，PTC病變是加劇腎間質纖維化的重要原因。內皮細胞損傷和修復功能減退是導致PTC網丟失減少的主要原因。內皮細胞損傷后的分泌失調是微血管病變發展和演變過程中的重要特征。NO主要由血管內皮細胞合成，eNOS是NO合成的限速酶，通過催化L-精氨酸合成NO發揮生物學功能，eNOS/NO途徑參與內皮細胞功能調節和血管生成，在維持微血管密度中起重要作用。研究顯示eNOS敲除小鼠可存在先天性的腎臟發育異常，eNOS缺陷可導致嚴重的腎損傷［1］，提示eNOS/NO在腎臟病的發生發展中扮演著重要角色。本研究通過觀察單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）小鼠腎組織eNOS、VEGFmRNA、血清NO表達變化，計數PTC密度，探討eNOS/NO途徑對腎間質纖維化微血管病變的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡SPF級雄性KM小鼠，體重37～40 g，來源于廈門大學實驗動物中心［SCXK（閩）2013-0001］。無菌手術在廈門大學實驗動物中心屏障環境動物實驗室進行［SYXK（閩）2013-0006］，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。PE標記抗小鼠CD133與同型對照（PE-CD133：E028258及Isotype control：E028728）、Pacific Blue標記抗小鼠VEGFR-2與同型對照（Pacific Blue：E031625及Isotype control：E022113）購于美國eBioscience公司。免疫組化檢測兔抗小鼠多克隆抗體CD34（BA0532，抗體購于武漢博士德生物有限公司。Trizol購于Invitrogen公司（Cat no15596-026）。SYBR? Premix Ex TaqTMII實時定量反轉錄試劑盒（RR420A）購于TaKaRa公司。Real-time PCR所有引物由TaKaRa公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers

1.2 動物分組及模型建立

64只SPF級雄性KM小鼠隨機分為模型組（UUO組，n=32）和假手術組（sham組，n=32）。UUO組小鼠10%乙醚麻醉后經右側恥骨上切口，行右側輸尿管游離結扎。Sham組僅游離右側輸尿管及右腎，不結扎，不切斷。分別于實驗第7、14、21、28天每組各隨機抽取8只動物處死，處死當日眼球取血，其中約200μL滴入末梢血EDTA抗凝管備流式細胞檢測，其余以干燥管取上層血清備NO、BUN、Cr檢測。

1.3 血生化指標檢測

硝酸還原酶法測定血清NO。

1.4 外周血內皮祖細胞流式細胞檢測

（1）外周抗凝血50μL分置2個離心管，一管中加入5μL PE標記抗小鼠CD133及2.5μL Pacific-Blue標價抗小鼠VEGFR2，另一管加入等量同型對照，充分震蕩后室溫避光靜置50 min。每份標本滴加紅細胞裂解液200μL，避光20 min。4℃3000 r/min×3 min，吸取上清液后PBS洗滌3次后懸浮，調節細胞濃度至105個/mL。用Partec CyFlow Space流式細胞儀以其配套的Partec PASCell Quest軟件進行流式細胞分析。檢測由廈門大學醫學院中心實驗室協助完成。

1.5 腎臟病理形態學檢測

常規制作2μm石蠟切片做Masson染色。

1.6 免疫組化檢測CD34表達計數PTC密度

采用SP法，以PBS代替一抗做陰性對照染色，染色步驟按試劑盒說明。CD34染色計數PTC密度：一抗為兔抗小鼠多單隆抗體CD34（1：100），二抗為滴加生物素化兔抗山羊IgG，PTC計數［9］：任何1個棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇作為一條微血管，只要結構不相連，分支結構也作為一條血管計數（除外大血管）。每個標本盲法隨機觀察腎皮質區不含腎小球的10個高倍鏡視野（×400，0.065 mm2），計數陽性的毛細血管腔個數，得出PTC密度（個/mm2）取平均值。

1.7 Real-time PCR測定

腎皮質VEGF、eNOSmRNA的表達量：腎皮質稱重約100 mg，加入Trizol試劑1 mL勻漿，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，反轉錄為cDNA。按三步法 LightCycler? Real-time PCR擴增儀（型號G10120）進行實時定量PCR。PCR程序：預變性95℃ 30 s；擴增95℃5 s、60℃15 s、72℃15 s，45個循環；熔解曲線分析：95℃15 s，65℃60 s。定量PCR反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTMII（2×）10.0μL，PCR forward primer（10μmol/L）0.8μL PCR reverse primer（10μmol/L）0.8μL，DNA模板2.0μL，dH2O 6.4μL，總體系20.0μL。

1.8 統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件包進行數據統計學分析。計算數據以均數±標準差（±s）表示。組間計量資料比較用t檢驗，指標間相關性用Pearson相關分析，均為雙側檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠血清NO變化

UUO組造模后第一周血清NO開始下降，一周后各時間點與Sham組差異有統計學意義（見表2）。

2.2 兩組小鼠流式細胞檢測外周血單個核細胞CD133+/v FGFR+雙陽性細胞結果

造模后UUO組CD133+/VEGFR+雙陽性細胞持續降低，2、3、4周與Sham組差異有統計學意義，見圖1、2及表3。

表2 兩組小鼠血清NO比較（μmo/L，xˉ±s，n=8）Tab.2 Comparison of serum NO levels in themice

表3 兩組小鼠CD133+/VEGFR2+雙陽性細胞流式細胞檢測結果（%，xˉ±s，n=8）Tab.3 Comparison of CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in themice determined by flow cytometry

2.3 兩組小鼠腎組織病理

Masson染色sham組腎組織形態正常，UUO組見腎小管擴張及少數蛋白管型，腎間質纖維化逐漸加重，腎小管間質藍染物質明顯增多，見圖3。

2.4 兩組小鼠免疫組化監測腎間質CD34表達及PTC計數

免疫組化染色棕黃色細胞作為CD34陽性細胞，正常內皮細胞胞膜著色。Sham組PTC密度豐富，分布均勻，形態大致規則。UUO組PTC病變呈局灶性分布，隨造模時間延長，PTC密度逐漸降低，排列紊亂，見圖4。計數PTC密度，UUO組明顯降低，第2、3、4周與sham組差異有統計學意義，見表4。

2.5 兩組小鼠腎組織eNOSmRNA、v FGF mRNA表達

UUO組eNOSmRNA、VEGF mRNA表達持續下降，2周起與Sham組差異有統計學意義（圖5及表5）。

注：A：Sham組（1周）；B：Sham組（2周）；C：Sham組（3周）；D：Sham組（4周）。圖2 Sham組小鼠各時間點流式細胞圖Note.A：Sham group，1week；B：Sham group，2 weeks；C：Sham group，3 weeks；D：Sham group，4 weeks.Fig.2 CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in peripheral blood mononuclear cells of the sham group at different times

注：A：Sham組；B：UUO組（1周）；C：UUO組（2周）；D：UUO組（3周）；E：UUO組（4周）。圖3 兩組小鼠腎臟病理（Masson，×200HPF）Note.A：Sham group；B：UUO group（1week）；C：UUO group（2 weeks）；D：UUO group（3 weeks）；E：UUO group（4weeks）.Fig.3 Morphological changes in the renal tissue under opticalmicroscope（Masson staining，×200HPF）

表4 UUO組及Sham組小鼠腎間質PTC計數（個/mm2，xˉ±s，n=8）Tab.4 Counting of peritubular capillaries in the UUO and sham groups.

注：A：Sham組；B：UUO組（1周）；C：UUO組（4周）。圖4 兩組小鼠腎間質CD34染色結果（免疫組化×100HPF）Note.A：Sham group；B：UUO group（1week）；C：UUO group（4 weeks）.Fig.4 The expression of CD34 of renal interstitium by immunohistochemical staining

表5 兩組小鼠腎組織eNOSmRNA、VEGFmRNA表達（PI，xˉ±s n=8）Tab.5 The expression of eNOSmRNA and VEGFmRNA in renal tissue of themice.

注：A：GAPDH；B：eNOS；C：VEGF。圖5 Real-time PCR擴增曲線Note.A：GAPDH；B：eNOS；C：VEGF.Fig.5 Amplification curves of the real-time-PCR analysis

2.6 Pearson相關分析顯示

UUO小鼠血清一氧化氮水平與腎間質微血管密度呈正相關（r=0.715，P＜0.05）；eNOSmRNA表達水平與腎間質微血管密度（r=0.624，P＜0.05）、內皮祖細胞計數（r=0.375，P＜0.05）、VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）呈正相關。

3 討論

內皮細胞的損傷和再生修復功能減退是導致PTC丟失的主要原因。eNOS/NO與內皮細胞功能及血管生成密切相關，eNOS基因敲除小鼠可導致進展期局灶性腎損傷，且局部病變的嚴重程度與PTC密度呈正相關，維持eNOS表達，能減少PTC損傷，從而延緩RIF的病理進程［2］。本研究顯示UUO組成模后eNOS、NO水平呈持續下降趨勢，eNOS、NO與PTC密度存在顯著直線正相關，提示eNOS/NO參與了腎間質纖維化微血管病變的發生發展。

eNOS/NO途徑可能通過多種機制參與PTC的調節。慢性腎損傷進展過程中炎癥因子、缺氧等因素損傷內皮細胞，NO等舒血管物質分泌減少，ET-1等縮血管物質釋放增加，可進一步加劇內皮細胞的損傷，導致間質纖維化進展中微血管病變的惡性循環［3］。NO是目前所知最強的內皮源性舒血管因子之一，能維持正常內皮舒張抑制痙攣收縮，清除自由基，抑制脂質過氧化反應，保持PTC正常的形態學結構和功能。本研究顯示UUO組NO表達持續下降，提示eNOS/NO對血管舒張功能的調節可能參與了PTC密度的維持。

eNOS/NO途徑是血管生成必須的調節因子，參與調節內皮細胞的生長、凋亡、遷移以及干細胞動員、募集，在不同組織的血管生成過程中都起重要作用［4］。給予肢體缺血的家兔口服Lˉ精氨酸后缺血肢體血管生成明顯增加，而eNOS基因缺失時缺血肢體的血管生成明顯減弱［5］。慢性腎臟病變過程中eNOS/NO途徑可能通過參與血管的生產而維持腎間質微血管密度。

VEGF是一個強有力的促血管生成因子，近年來的研究已經證實它在新生血管形成過程中居于中心地位［6，7］，血管再生能力的下降伴隨eNOS和VEGF表達減少。本研究UUO組VEGF表達持續下降，相關分析顯示與eNOSmRNA表達呈直線正相關。提示介導促血管生長因子的血管新生作用可能參與了，是eNOS/NO維持PTC可能機制。

外周血EPCs是血管內皮細胞的前體細胞，eNOS/NO參與干細胞的動員及分化，eNOS的基因缺陷將造成EPCs動員障礙而影響新生血管生成［8］。研究顯示Ⅱ型糖尿病患者EPC血管生成能力下降伴eNOSmRNA、蛋白表達下調，NO分泌降低，補充外源性NO，血管生成的數量、復雜程度增加，提示糖尿病患者血管生成能力降低與NO合成減少有關［9］。在Verma等［10］的研究中發現，C反應蛋白（CRP）通過抑制eNOS的表達從而抑制EPC增殖及遷移能力，本研究UUO組外周血EPCs數量持續下降，與eNOS表達呈正相關，提示動員EPCs是 eNOS/NO途徑調控微血管密度的機制之一［11］。

綜上所述，eNOS/NO途徑對微血管的調控作用可能對慢性腎損傷產生影響的機制之一，eNOS/NO對微血管的調控有多種機制參與，臨床用藥物調控eNOS/NO途徑從而影響內皮細胞修復及血管再生過程，將可能產生腎臟保護作用。

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Role of eNOS/NO signaling pathway in peritubular capillary lesions in renal interstitial fibrosis and the related mechanism in mousemodels of unilateral ureteral obstruction

CHEN Yan1，NIU Tong2，BAIHai-tao1*，YANG Xiao-jing1，ZHANG Yan-lin3，YANG Qin-yu4
（1.Department of Pediatrics，2.College of Basic Medical Sciences，Jilin Univercity，Changchun 130000，China；3.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital，Xiamen University，Xiamen 361003；4.Department of Pediatrics，Mianyang Central Hospital，Mianyang 621099）

Ob jectiveTo investigate the role of eNOS/NO signaling pathway in peritubular capillary lesions of mouse renal interstitial fibrosiswith unilateral ureteral obstruction（UUC）and the potentialmechanism.M ethodsSixtyfour healthymale KM mice were randomly divided into sham operated group（n=32）and unilateral ureteral obstruction group（n=32）.At each week，serum BUN，Scr and NO were determined and the percentages of CD133+/VEGFR+endothelial progenitor cells in peripheral blood mononuclear cells were detected by flow cytometry.Morphological changes of the renal tissue were observed using Masson staining.The expression of CD34+cells in the renal interstitium was analyzed by immunohistochemistry to calculate the peritubular capillary density.The expressions of eNos and VEGFmRNA were determined by real-time PCR.ResultsThe expression of blood NO，the percentages of endothelial progenitor cells，peritu-bular capillaries，eNOSmRNA，and VEGFmRNA in the UUO group were significantly decreased compared with those of the sham group at2，3，and 4 weeks（P＜0.05）.NO was positively correlated with peritubular capillaries（r=0.715，P＜0.05），eNOSmRNA was positively correlated with peritubular capillaries（r=0.624，P＜0.05），endothelial progenitor cells（r=0.375，P＜0.05），and VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）.ConclusionseNOS/NO signaling pathway participates in regulation of peritubular capillary lesions in renal interstitial fibrosis of UUOmice.Themechanism may be partly related to the regulation of vasomotor reflex，the expression of VEGFmRNA and mobilization of endothelial progenitor cells.

Endothelial nitric oxide synthase；Nitric oxide；Peritubular capillary；Endothelial progenitor cells；Angiogenesis growth factor；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0484-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.008

2015-04-24

福建省衛生廳青年科研課題（編號：2010-2-92）。

陳雁（1984ˉ），女，主治醫師，碩士，專業：小兒腎臟病，Email：ccynthia0324@hotmail.com。Δ共同第一作者。

白海濤（1967ˉ），女，主任醫師，博士，研究方向：干細胞與腎臟再生。Email：baihaitao@163.com

64只KM小鼠隨機分為兩組：假手術組n=32只；單側輸尿管梗阻UUO組n=32只。觀察4周，每周檢測各組小鼠血BUN、Scr及一氧化氮，流式細胞計數外周血CD133+/VEGFR+內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、Masson染色觀察腎組織形態學變化，免疫組化法檢測腎間質CD34+表達計數微血管密度，實時定量PCR檢測腎皮質eNOS、VEGFmRNA表達。結果UUO組血一氧化氮、內皮祖細胞計數、腎間質微血管密度、eNOS、VEGF mRNA表達水平持續下降，在第2、3、4周與對照組差異有統計學意義。一氧化氮水平與腎間質微血管密度呈正相關（r=0.715，P＜0.05）；eNOSmRNA表達水平與腎間質微血管密度（r=0.624，P＜0.05）、內皮祖細胞計數（r= 0.375，P＜0.05）、VEGFmRNA（r=0.351，P＜0.05）呈正相關。結論eNOS/NO途徑參與了UUO小鼠腎間質微血管的調節，其調節涉及對血管舒張功能影響、介導促血管腎臟因子VEGFmRNA表達及動員內皮祖細胞等機制。