RNA干擾抑制Beclin1基因對裸鼴鼠成纖維細胞增殖與凋亡的影響

趙善民，肖邦，林麗芳，宮晨，王運慧，程繼帥，余琛琳，叢薇，湯球，孫偉，崔淑芳

（第二軍醫大學實驗動物中心，上海 200433)

研究報告

RNA干擾抑制Beclin1基因對裸鼴鼠成纖維細胞增殖與凋亡的影響

趙善民，肖邦，林麗芳，宮晨，王運慧，程繼帥，余琛琳，叢薇，湯球，孫偉，崔淑芳*

（第二軍醫大學實驗動物中心，上海 200433)

目的應用RNA干擾技術抑制自噬調控基因Beclin 1的表達，檢測Beclin 1表達對裸鼴鼠皮膚成纖維細胞增殖與凋亡的影響以及p53、BAX、Bcl2等基因表達的影響。方法分別檢測裸鼴鼠成纖維細胞經饑餓、H2O2刺激等處理后Beclin 1的表達，然后采用設計的Beclin l基因的干擾RNA及陰性對照分別瞬時轉染裸鼴鼠成纖維細胞。采用real-time PCR及Western blot法檢測沉默效果后，采用CCK-1實驗檢測沉默后細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，然后采用Western blot檢測相關基因蛋白表達水平。結果饑餓與H2O2刺激均能導致Beclin 1表達水平的改變。采用gene expresso轉染試劑對裸鼴鼠皮膚成纖維細胞轉染效率可達到90%以上，real-time PCR及Western blot結果顯示所設計的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表達。Beclin 1基因沉默后，裸鼴鼠皮膚成纖維細胞增殖抑制率均顯著高于對照組，細胞早期凋亡與晚期凋亡率均顯著升高，同時p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表達量下降。結論Beclin 1在裸鼴鼠成纖維細胞抵抗饑餓、H2O2刺激等過程中表達量顯著變化，同時抑制Beclin 1的表達，可抑制裸鼴鼠細胞增殖，促進其凋亡，這提示Beclin 1基因對裸鼴鼠自噬、增殖、凋亡起到調控作用。

裸鼴鼠；成纖維細胞；Beclin 1；RNA干擾；增殖；凋亡

裸鼴鼠是一種具備抗腫瘤、抗衰老、耐低氧等優勢生物學特征的新型實驗動物資源，目前已被科學家應用于腫瘤學、免疫學及心血管學等領域的研究[1-3］。研究表明裸鼴鼠在抗腫瘤方面具有多種特殊的分子信號機制抵抗細胞的過量增殖及腫瘤的產生，例如裸鼴鼠獨特的早期接觸抑制機制，其成纖維細胞分泌高分子質量的透明質酸（HMM-HA)等[4，5］。Beclin 1是調控自噬的重要基因，研究顯示乳腺癌、腦腫瘤、宮頸癌、卵巢癌中出現Beclin 1蛋白表達的下降[6，7］。多種腫瘤已經證實存在Beclin 1等自噬基因的缺陷，能夠逃避自噬性死亡。因此，多數學者認為Beclin 1是一種抑癌基因。同時Beclin 1作為參與自噬發生的特異性基因，是自噬發生的重要調控分子，在自噬形成過程中起重要作用。自噬的發生過程需要多種分子的參與，其調控機制非常復雜。前期我們發現，新生裸鼴鼠肝臟、肺臟等組織中自噬水平顯著高于C57BL/6小鼠[8，9］。本實驗進一步研究了自噬相關基因Beclin1表達下調之后對裸鼴鼠細胞增殖與凋亡的影響，為深入探討Beclin 1在裸鼴鼠自噬、凋亡中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼴鼠原代皮膚成纖維細胞按照本實驗室前期方法分離培養[10］；主要試劑有細胞裂解液 RIPA、PMSF、預染蛋白marker均購自上海碧云天生物技術有限公司；AKT（Phospho-Ser473)抗體、mTOR抗體、BAX抗體購自美國Signalway Antibody公司；βactin、p53抗體、Bcl2抗體購自美國Proteintech公司；Beclin 1抗體購自英國Abcam公司；LC3 B抗體購自美國Cell Signaling公司；Annexin V-PI雙染色法試劑購自美國BD公司；gene expresso轉染試劑購自南京邁極生物公司；CCK8檢測試劑盒購自美國Signalway Antibody公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞準備

細胞接種于直徑60 mm的培養皿中，接種密度1×106/皿，在37℃三氣培養箱中培養。細胞培養采用三氣培養箱控制條件為3%O2、5%CO2及 92%N2。隔天換液一次，3 d傳代。裸鼴鼠成纖維細胞的刺激分為3組:饑餓處理組、H2O2處理組、正常組。饑餓處理是指用無血清的培養基進行培養。H2O2處理采用900μmol/L H2O2進行共孵育。正常組為3%O2、5%CO2。用于Beclin 1 siRNA轉染的細胞于轉染前一天進行鋪板，細胞用不含抗生素的正常生長的培養基進行培養。用于細胞RNA、蛋白提取及凋亡率檢測的細胞置于6孔板中培養，用于CCK8檢測的細胞置于96孔板中培養。

1.2.2 siRNA轉染

當6孔板中的細胞達到90%時進行轉染，轉染按照Gene Expresso轉染試劑說明書進行，具體為，取240μL Opti-MEM培養液于EP管中，加入10μL siRNA，另取240μL Opti-MEM培養液加入10μL gene expresso，放置5 min后輕輕混勻，再室溫放置20 min，然后向其中加入1.5 mL培養液混勻后置換培養細胞中的培養液，同時轉染Cy3標記的siRNA，觀察轉染效率。培養48 h后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。Beclin 1 siRNA序列為:5’-CUCAAGUUCAUGCUGACCAdTdT-3’和 5’-UGGUCAGCAUGAACUUGAGdTdT-3’[11］，引物序列由百奧生物技術（南通)有限公司合成。

1.2.3 RNA的提取

Beclin 1 siRNA轉染24 h后，采用TRIzol試劑盒抽取裸鼴鼠皮膚成纖維細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測260/280比值，初步確定總RNA的濃度及純度。然后用DNase I去除總RNA中的基因組DNA。將RNA按照Takara逆轉錄試劑盒操作程序反轉錄成cDNA。

1.2.4 Real-time PCR檢測相關基因的表達

對各組織總RNA進行反轉錄合成cDNA，將cDNA進行2倍稀釋作為檢測模板，按照設定的反應體系和反應程序，檢測各組織中Becin 1 mRNA的轉錄水平。熒光定量PCR儀（美國ABI公司)設置反應程序為:95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，72℃30 s，40個循環，應用比較Ct法進行相對定量。Real-time PCR反應體系為:cDNA模板 1μL，2× SYBR Premix Ex Taq 5μL，上、下游引物（10μmol/ L)0.2μL，ROX Reference Dye（50×)0.2μL，ddH2O 3.4μL，同時設置陰陽性對照，每個樣品設3個重復孔。參考Genbank上發表的裸鼴鼠Beclin1、GAPDH基因序列設計引物為:Beclin 1:5’-GTTCAAAGAGGAGGTGGAGAAG-3’和5’-GAGGAA ACCCAGGCAAG AC-3’；GAPDH:5’-CGCCTGCTTCACCACCTT-3’and 5’-CCTGCCGCCTGGAGAAA-3’，引物序列由上海生工合成。

1.2.5 細胞蛋白的提取

Beclin 1 siRNA轉染24 h后，取6孔板細胞加0.1 mL預冷的 RIPA裂解液（含有 100 mmol/L FPSM進行勻漿)，冰浴30 min后4℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清蛋白，采用Micro BCA Protein Kit測定細胞蛋白總濃度。

1.2.6 Western Blot檢測

取適量總蛋白加2×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。SDS-PAGE分離后轉印至硝酸纖維素膜，用1×封閉液室溫封閉1 h，一抗用Beclin 1、LC3B、p53、BAX、BCL2、p-AKT、mTOR抗體（1∶2000稀釋)，4℃過夜；TBST洗3次，每次5 min，二抗（1∶2000稀釋)室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min，用化學發光（ECL，普利萊公司)顯色。以β-actin為內參照，凝膠成像系統掃描成像。

1.2.7 流式檢測基因沉默后細胞凋亡率

Beclin 1 siRNA轉染24 h后，取6孔板細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌2次（1000 r/min離心5 min)，收集細胞，加入500μL的binding buffer懸浮細胞，加入10μL annexin V-FITC和10μL PI，混勻后室溫避光防止5～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.8 CCK8檢測基因沉默后細胞增殖率

Beclin 1 siRNA轉染 6、12、24、48 h后進行CCK8計數，按照說明書進行操作，用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其吸光度（A)值，以間接反映各組活細胞數量。

1.2.9 數據處理

檢測數據用SPSS 12.0軟件進行統計，分析不同處理組凋亡率的不同，統計結果用“均數±標準差”表示，并作t檢驗。

2 結果

2.1 不利刺激對裸鼴鼠皮膚成纖維細胞Beclin1表達的影響

饑餓、H2O2刺激均能導致Beclin 1表達水平的改變。如圖1所示，裸鼴鼠成纖維細胞饑餓或者H2O2刺激24 h后，Western blot檢測結果均顯示Beclin 1表達水平顯著下降（圖1A和1B)。

圖1 不同刺激下裸鼴鼠成纖維細胞Beclin1的表達水平Fig.1 Expression of Beclin1 in different stimulated fibroblasts from the naked mole rat

2.2 Beclin1基因沉默效果的檢測

采用Gene Expresso轉染試劑對裸鼴鼠皮膚成纖維細胞進行siRNA轉染，轉染效率可達到90%以上（如圖2A和2B)。同時real-time PCR及Western blot結果顯示，采用Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表達（如圖2C和2D)。

2.3 Beclin1基因沉默對裸鼴鼠皮膚成纖維細胞增殖及凋亡的影響

在轉染后的各時間點，裸鼴鼠皮膚成纖維細胞增殖抑制率均顯著高于對照組。同時，Beclin 1基因沉默24 h后，細胞早期凋亡與晚期凋亡率均顯著升高（見圖3、4，P值均＜0.01)。

2.4 Beclin1基因沉默對凋亡相關基因的影響

如圖5所示，Beclin 1基因沉默24 h后，LC3B I與II總量及比值發生了變化，PI3K/AKT/mTOR信號通路中p-AKT（Ser473)與mTOR表達量下調，同時與凋亡密切相關的p53、Bcl2、BAX表達量亦下調。

3 討論

Beclin 1基因與酵母自噬基因Atg6同源，是介導其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關鍵因子，也是參與哺乳動物自噬體形成調控的特異性基因[12］。目前在多種腫瘤中發現了Beclin 1單等位基因的缺失或者Beclin 1蛋白表達下調，提示其與腫瘤的發生、發展和疾病的發生密切相關。但Beclin 1相關抑癌機制目前仍不很清楚，現有研究主要集中在Beclin 1作為一種自噬基因具有誘導自噬、凋亡及抗基因組突變的作用上。前期我們研究發現饑餓、H2O2刺激均能誘導裸鼴鼠成纖維細胞及肝星形細胞自噬水平的升高[11］，本研究結果顯示裸鼴鼠細胞饑餓條件下，Beclin 1蛋白表達量顯著降低，H2O2刺激亦可導致Beclin 1表達水平的下調，這提示Beclin 1在裸鼴鼠細胞抵抗饑餓及H2O2刺激時起作用。Beclin 1基因沉默可顯著抑制裸鼴鼠皮膚成纖維細胞增殖及誘導凋亡產生，與凋亡密切相關的Bcl2、BAX表達量亦下調，并且LC3B總量發生了變化，說明Beclin 1在裸鼴鼠自噬、增殖及凋亡中均發揮作用。McKnight等證實對于人類骨肉瘤HOS細胞，下調Beclin 1基因能夠增強順鉑等誘導的細胞凋亡[13-15］。這也提示Beclin 1基因下調可以增強化療藥物對凋亡信號通路的激活，有助于控制腫瘤的增殖。因此，對Beclin 1基因進行更加深入的研究將有助于腫瘤的控制。

圖2 Beclin1基因沉默效果Fig.2 The effect of Beclin 1 gene silencing

圖3 轉染24 h后裸鼴鼠成纖維細胞凋亡率Fig.3 Apoptosis of naked mole rat fibroblasts transfected for 24 h

圖4 轉染6、12、24、48 h后裸鼴鼠成纖維細胞增殖率（n=5)Fig.4 Proliferation rate of fibroblasts of the naked mole rat at 6，12，24 and 48 h after transfection（n=5)

圖5 Beclin1沉默后蛋白表達水平Fig.5 Protein expression of naked mole rat fibroblasts after siRNA inhiibtion of Beclin 1

研究顯示p53是平衡腫瘤及衰老的一個重要分界點，保持p53基因的穩態表達是預防腫瘤和早衰的策略之一[16-18］。同時p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導細胞凋亡中發揮極其重要的作用。Jiang等[19］對頭頸部的腺樣囊性癌組織分析發現p53與Beclin 1表達量正相關。Liu等[13］研究發現Beclin 1可影響USP10和USP13的去泛素化活性，從而對p53蛋白水平進行調控。因此，裸鼴鼠皮膚成纖維細胞Beclin 1基因下調之后，p53基因表達量的下調，提示Beclin 1可能調控p53的表達。同時Beclin 1基因沉默后細胞凋亡率升高，這表明下調裸鼴鼠細胞Beclin 1基因可以通過p53非依賴信號通路介導凋亡發生。此外，我們發現下調Beclin 1基因后，p-AKT（Ser473)、mTOR表達量降低，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路受到抑制。另有學者研究發現Beclin 1的缺失能夠干擾PI3K-VPS34復合物的形成[20］。Beclin 1基因下調伴隨PI3Kp85α與p-AKT的表達下調，同時細胞增殖率下降，凋亡率升高[21］。這些數據說明Beclin 1基因下調可以通過PI3K/AKT信號通路介導細胞凋亡。

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Inhibitorj effects of Beclin 1 gene expression bj RNA interference on the proliferation and apoptosis in fibroblasts of naked mole rat

ZHAO Shan-min，XIAO Bang，LIN Li-fang，GONG Chen，WANG Yun-hui，CHENG Ji-shuai，YU Chen-lin，CONGWei，TANG Qiu，SUNWei，CUIShu-fang
（Laboratory Animal Center of the Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulation of Beclin 1，which is an autophagy regulatory molecule，expression induced by RNA interference on the proliferation and apoptosis in skin fibroblasts of naked mole rat.M ethodsThe expression levels of Beclin 1 were detected after starvation or H2O2treatment.The fibroblasts were transiently transfected with specific siRNA targeting Beclin 1 and then screened by real-time PCR and Western blot.Cell proliferation and apoptosis were determined using CCK-8 detection kit and flow cytometry（FCM).The expressions of related geneswere detected by Western blot.ResultsThe expression of Beclin 1 gene atmRNA and protein levels was significantly lower in fibroblasts of the nakedmole rat.Starvation and H2O2treatment induced changes of the Beclin 1 expression. Inhibition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce early and late apoptosis.The protein levels of p53，BAX，Bcl2，LC3B，p-AKT and mTOR were reduced after transient transfection with Beclin 1-siRNA.ConclusionsThe expression of Beclin 1 in fibroblasts of nakedmole ratare changed in response to starvation or H2O2stimulation.Inhi-bition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce apoptosis.Therefore，Beclin1 gene may play a regulatory role in autophagy，proliferation and apoptosis in the skin fibroblasts of naked mole rat.

Naked mole rat；Fibroblasts；Beclin 1；siRNA；Proliferation；Apoptosis

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0557-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.002

2015-11-15

國家科技支撐計劃（No.2015BAI09B02)；國家自然科學基金（No.31402028)與上海市衛計委課題（No.20144Y0205)聯合資助。

趙善民（1986-)，男，碩士，講師，研究方向:實驗動物標準化及人類疾病動物模型研究。

崔淑芳，教授，研究方向:實驗動物標準化及人類疾病動物模型研究。Email:youngstar_sf@163.com，