日本囊對蝦金屬硫蛋白基因cDNA的克隆及組織表達分析

石壯壯，毛 勇，喬 瑩，王 軍*

（廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102）

日本囊對蝦金屬硫蛋白基因cDNA的克隆及組織表達分析

石壯壯，毛 勇，喬 瑩，王 軍*

（廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102）

根據日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）轉錄組中的金屬硫蛋白（metallothionein，MT）基因片段，使用RACE基因快速測序法，獲得日本囊對蝦MT（Mj MT）c DNA全長.Mj MT cDNA序列全長549 bp，包含177 bp的開放閱讀框（ORF），68 bp的5′非編碼區（UTR）及304 bp 3′UTR，編碼58個氨基酸.在其編碼的氨基酸中半胱氨酸含量豐富，占氨基酸總量的31.0%，不含芳香族氨基酸，富含MT典型的Cys-X（1～3）-Cys結構.多序列對比表明，Mj MT cDNA序列與斑節對蝦（Penaeus monodon）的MT cDNA序列相似度最高，為76%.Real-time PCR結果表明，Mj MT表達存在組織差異，其表達量在鰓組織中最高，其次是胃和肝胰腺.

金屬硫蛋白；日本囊對蝦；克隆；組織表達

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類廣泛存在于生物體中的低分子質量金屬結合蛋白，富含半胱氨酸殘基［1］，Cys-X-Cys（X為除Cys以外的其他氨基酸）三膚序列是MT的特征序列.MT一般有2個獨立的結構域，整個分子呈啞鈴狀，氨基末端的β結構域有9個半胱氨酸殘基，梭基末端的α結構域有11個半胱氨酸殘基［2］.MT具有重金屬解毒、維持微量元素平衡、清除體內自由基等生物學功能［3］，能夠與MT結合并誘導其表達的金屬主要有Cd、Zn、Pb、Hg、Cu、Bi等，其金屬誘導的能力順序為：Cd＞Zn＞Cu＞Hg［4］.

隨著社會經濟的發展和人類活動的加劇，大量重金屬污染物進入近海海域，引起海水質量惡化，嚴重破壞海洋生態系統的結構和功能［5］.重金屬可以沿著海洋食物鏈傳遞、富集、濃縮，最終進入處于食物鏈頂端的人類體內，危害人體健康［6］.20世紀70年代末即有學者提出以生物組織中的MT含量作為水環境監測重金屬暴露的一個分子生態毒理學指標，以期為確定水環境污染程度提供綜合和客觀的指標［］.

對蝦MT的研究目前尚處于起步階段，已有凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）［8］、斑節對蝦（Penaeus monodon）［9］和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）［10］的MT cDNA序列測定的報道，但日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）MT（Mj MT）cDNA的序列尚且未知.本研究獲得了Mj MT cDNA序列，以及Mj MT在日本囊對蝦不同組織中的表達量，為開展將MjMT作為日本囊對蝦養殖環境污染監測的生物指標的研究，提供了理論基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗采用的日本囊對蝦來源于福建省漳州市東山縣赤山茂鑫水產有限公司的對蝦養殖池塘，從養殖池中隨機選取健康對蝦5尾（體質量為（4.77±0.90）g），提取對蝦肝胰腺、鰓、肌肉、胃、腸、眼柄、心等7種組織，于RNA保存液中，￣80℃保存，用于RNA的提取.

1.2 Mj MT cDNA克隆

根據日本囊對蝦轉錄組中的MT cDNA片段，設計5′和3′端特異性引物（表1中F1、R1、F2、R2），采用cDNA末端快速擴增技術（RACE）擴增Mj MT c DNA的5′和3′末端.

表1 Mj MT c DNA克隆測序及real-time PCR中所用的引物Tab.1 Primers used to amplify the Mj MT cDNA full length and real-time PCR

在3′RACE中，利用巢式PCR方法，首先用F1和RA進行PCR反應，所得的產物稀釋10～50倍后，取1 μL作為模板，利用F2和RA再進行PCR擴增.PCR反應體系為：10×Buffer 2.5μL，d NTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物10 nmol/m L各0.5μL，模板0.5μL，2.5 U/ μL的Taq酶0.5μL，使用蒸餾水將反應體系補充至25 μL.反應條件為：95℃變性5 min；95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃延伸10 min.

在5′RACE中，利用末端轉移酶和d ATP在cDNA末端加上poly（A）尾巴，以加尾后的cDNA為模板，進行如下PCR反應：10×Buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol/L）5μL，引物Oligo d T-RA（10 nmol/m L）各1 μL，引物RA和R1（10 nmol/m L）各1.5μL，模板（100μg/m L）2μL，2.5 U/μL的Taq酶0.5μL，使用蒸餾水將反應體系補充至50μL.反應條件為：95℃5 min；57℃5 min；72℃60 min；95℃45 s，57℃45 s，72℃60 s，30個循環；72℃延伸10 min.

所得的產物經1%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒對目的片段進行純化回收，純產物與p MD18-T載體連接，轉化于大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，將PCR檢測為陽性的克隆送上海生工生物工程股份有限公司測序.利用VecScreen去除測序結果中的載體序列.利用DNAStar中的Edit-Seq對所得的片段以及5′和3′序列進行拼接和重疊序列的去除，最終獲得Mj MT cDNA基因序列，并于序列首尾設計引物（F4/R4）進行PCR檢驗.

1.3 Mj MT cDNA序列分析

利用BLAST對所得的cDNA序列與GenBank中的核酸數據庫及蛋白質數據庫進行比對分析，尋求與Mj MT c DNA高度同源的序列.利用Expasy中的Prot Param程序統計MT中各種氨基酸含量并預測其理論分子質量和等電點.在Gen Bank中獲得不同物種MT的蛋白序列，使用MEGA5.0軟件中基于距離的鄰接法（N-J法）構建系統進化樹，分支置信度采用自展法（BP法）重復檢驗1 000次.

1.4 Real-time PCR分析Mj MT組織表達量

提取日本囊對蝦各組織的總RNA，用ND2000檢測RNA溶液的濃度后，采用Ta KaRa公司的Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄.根據已得的Mj MT cDNA序列，利用引物設計軟件Primer設計特異性熒光定量引物F3/R3，以及已知的日本囊對蝦內參基因（翻譯延伸因子）引物EFS20/EFA20（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成.制作標準曲線，確定目的基因與內參基因的擴增效率相等，再使用2￣ΔΔCt法進行相對定量.

熒光定量采用20μL體系，包括10μL的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×），0.4μL的ROX Reference DyeⅡ（50×），2μL的cDNA模板，引物各0.6μL，6.4μL的d H2O.PCR擴增程序為兩步法：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環；溶解溫度：95℃15 min，60℃1 min，95℃15 s.然后用2￣ΔΔCt法對熒光定量結果進行分析.

2 結 果

2.1 Mj MT cDNA序列

Mj MT cDNA（Gen Bank登錄號：KP226136）序列全長549 bp，包含177 bp的開放閱讀框（ORF），68 bp的5′非編碼區（UTR）及304 bp 3′UTR，編碼58個氨基酸（圖1）.序列對比結果顯示，Mj MT cDNA序列與斑節對蝦的MT cDNA序列相似度最高，為76%.通過軟件Prot Param分析得出該蛋白的理論分子質量為6 180.3 u，等電點8.28，不穩定指數（Ⅱ）為51.66，脂肪族指數為3.45.親水性總平均值（GRAVY）為￣0.719，表明MT是親水性蛋白.推測氨基酸分子式為C234H395N75O82S19.

圖1 日本囊對蝦MT基因cDNA全長及氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and amino acid sequence of MT gene from M·japonicus

從MT系統進化樹分析可以看出，日本囊對蝦與凡納濱對蝦、斑節對蝦和中國明對蝦聚集在一起，然后與鋸緣青蟹（Scylla serrata），中華絨贅蟹（Eriocheir sinensis），美洲贅龍蝦（Homarus americanus）等甲殼類匯集，與斑馬魚（Danio rerio）和人類（Homo sapiens）等高等脊椎動物，及擬南芥（Arabidopsis thaliana）等相距較遠，充分體現了物種之間的進化地位，與日本囊對蝦的實際生物學分類地位基本一致（圖2）.

2.2 Mj MT氨基酸特征序列

圖2 基于MT蛋白序列構建的NJ系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of MT by Neighbor-Joining

Mj MT富含MT典型的Cys-X（1～3）-Cys結構，其中有5個Cys-X-Cys結構，分別是CEC、CQC、CRC、CSC、CKC；3個Cys-X2-Cys結構，分別是CKSC、CSPC、CEKC；5個Cys-X3-Cys結構，分別是CKDRC、CKKGC、CTSGC、CAKTC、CQKPC；2個Cys-Cys結構.具有與其他甲殼類動物相同的特征序列CEKCXXXCXCX（CEKCTSGCSCP）（X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸）.

2.3 Mj MT組織表達

Mj MT基因表達廣泛存在于日本囊對蝦各組織中，肝胰腺、鰓、胃、腸、肌肉、心臟、眼柄中均有表達，但表達量存在差異，其表達量在鰓組織中最高，其次是胃和肝胰腺（圖3）.ANOVA單因素方差分析顯示，鰓、胃和肝胰腺的表達量之間存在顯著差異（p＜0.05）.肌肉、心臟、眼柄、腸的表達量都較低，并且相互之間差異不顯著.

圖3 MT m RNA在日本囊對蝦不同組織中表達量的相對值Fig.3 The expression of M·japonicus MT m RNA in different tissues

3 討 論

MT被定義為一個超家族，現MT超家族共分為脊椎動物MTs、軟體動物MTs、甲殼動物MTs、棘皮動物MTs、昆蟲動物MTs、線蟲MTs、原核生物MTs、植物MTs等15個家族.同一家族的MT共同擁有特有的序列特征并在進化上相關［11］.由系統進化樹可知，實驗所得MT與甲殼動物的同源性最高，并含有MT共有的特征序列，因此Mj MT蛋白屬于甲殼動物MTs.

在甲殼動物中，蟹類普遍存在CACC串聯重復序列［12］，串聯重復的CACC被認為是MT翻譯的結合位點［13］，但在Mj MT cDNA的3′UTR發現串聯重復序列為GAGG（圖1單下劃線標注）.對蝦屬中已知MT cDNA序列的凡納濱對蝦、斑節對蝦和中國明對蝦中均不存在串聯重復的CACC，但都含有GAGG的串聯重復.對蝦此串聯重復序列在位置上和蟹類的CACC相似，是否起同樣的功能，有待進一步研究. Mj MT cDNA還含有被認為是核酸降解信號的ATTTA［14］（圖1雙下劃線標注），以及典型的多聚腺昔酸加尾信號序列：AATAAA［12］（圖1波浪線標注）.

關于MT在甲殼動物組織中的分布情況，不同的研究者得到的結果有所差異.Chavez-Cooker等［15］研究美洲鰲龍蝦得到的結果顯示，肝胰腺MT的表達量大于鰓.Ren等［16］研究中華絨贅蟹MT在組織中分布的結果顯示，MT在肝胰腺的表達量顯著高于鰓、胃等其他組織.鄭麗明等［9］在斑節對蝦中的研究結果顯示，MT在卵巢中的表達量最高，其次是胃，而肝胰腺表達量最低.Wu等［17］在重金屬誘導凡納濱對蝦MT表達量變化的實驗中發現，鰓和肝胰腺中的MT表達量相近.

本研究中，Mj MT的表達量在鰓中最高，其次是胃和肝胰腺，與Amiard等［］的研究結果相似.Amiard等［］認為，在甲殼動物中，鰓為重金屬的攝取組織，胃、肝胰腺和腸等消化腺是重金屬的儲藏和排泄組織，這些組織中具有較高的MT表達量.肝胰腺MT的表達量雖然相對鰓和胃較低，但是高于肌肉、心臟等其他組織.在正常生理條件下，肝胰腺的MT表達量不高，但是在重金屬脅迫下，肝胰腺的MT表達量有明顯上升，并且有劑量效應［19］.

本研究從日本囊對蝦中獲得了Mj MT cDNA序列，以及Mj MT的組織分布情況，為開展研究以MT作為監測日本囊對蝦受重金屬污染的生物指標，提供了理論基礎.

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Clone and Gene Expression Analysis of Metallothionein from Marsupenaeus japonicus

SHI Zhuang-zhuang，MAO Yong，QIAO Ying，WANG Jun*
（College of Ocean＆Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China）

Based on the partial sequences of the metallothionein（MT）gene fragment in Marsupenaeus japonicus transcriptome，the complete cDNA sequence of MT of the shrimp was obtained by using RT-PCR and RACE.The full length of MT c DNA was 549 bp，encoded 58 amino acids with a 5′-untranslated region 68 bp and a 3′-untranslated region 304 bp.In the encoded protein，not any aromatic amino acid was found and the cysteines accounted for 31.0%of the total amino acid demonstrating the typical structure with Cys-X（1-3）-Cys type.Additionally，the M·japonicus MT gene shared a high identity up to 76%with the MT sequences of Penaeus monodon.Moreover，real-time PCR results showed the differential expression of MT cDNA in M·japonicus，with the highest expression in gill，followed in stomach and then in the hepatopancreas.

metallothionein；Marsupenaeus japonicus；clone；tissue expression

Q 781

A

0438-0479（2015）04-0464-05

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.04.004

2014-11-03 錄用日期：2015-01-13

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA10A409-03）；國家現代農業“蝦產業技術體系”（CARS-47）

*通信作者：junw＠xmu.edu.cn

石壯壯，毛勇，喬瑩，等.日本囊對蝦金屬硫蛋白基因cDNA的克隆及組織表達分析［J］.廈門大學學報：自然科學版，2015，54（4）：464-468.

：Shi Zhuangzhuang，Mao Yong，Qiao Ying，et al.Clone and gene expression analysis of metallothionein from Marsupenaeus japonicus［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，2015，54（4）：464-468.（in Chinese）