胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究

崔若辰，蔡報偉，蘇勁紅，胡鑫炎，孫雨涵，郭 權，周克夫

（廈門大學環境與生態學院，福建廈門361102）

胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究

崔若辰，蔡報偉，蘇勁紅，胡鑫炎，孫雨涵，郭 權，周克夫*

（廈門大學環境與生態學院，福建廈門361102）

檢測并分析胸腺素α原（prothymosinα，Pro Tα）在小鼠正常肝組織與肝腫瘤組織中表達、分布的情況.取20只昆明雄性小鼠隨機分為對照組和移植性肝癌模型組，每組10只，模型組接種H22肝癌組織，建立移植性肝癌模型.7 d后將模型組肝癌組織和對照組正常肝的組織取出，部分組織按常規石蠟包埋方法制片，免疫組織化學法分別檢測肝癌組織與正常肝組織中Pro Tα的表達分布情況；部分組織按提取胞質蛋白的方法獲得蛋白用于Western-blot分析.在Westernblot中，Pro Tα在肝癌組織細胞質的表達量明顯低于正常肝組織；在免疫組織化學法中，正常肝組織的細胞核呈陰性，胞質呈強陽性；而在肝癌組織中胞核呈強陽性，胞質呈弱陽性.Pro Tα在正常組織與腫瘤組織中的表達分布有明顯差異.由于在Western-blot中所提的蛋白主要為胞質蛋白，在癌變的組織中，Pro Tα主要集中在細胞核中，因此推測，當胞質中的Pro Tα大量表達時對于肝細胞穩定、抑制細胞發生癌變有重要功能，此結果為進一步研究Pro Tα在腫瘤發生和診斷中的作用提供了重要的理論依據.

胸腺素α原；H22細胞株；肝癌；定位

原發性肝癌（primary hepatic cancer）簡稱肝癌，是肝臟的惡性腫瘤，也是世界十大惡性腫瘤之一［1］.肝癌起病比較隱匿，早期癥狀不明顯，中期甚至部分晚期患者癥狀仍不明顯，一旦出現比較典型的癥狀，到醫院就診已多屬晚期，錯過最佳治療時期.根據最新統計［2］，全世界每年新發肝癌患者約78萬，居惡性腫瘤的第五位，因此，揭示肝腫瘤的癌變機理以及早期診斷是目前醫學研究的熱點.

胸腺素α原（prothymosinα，Pro Tα）是一種天然無二級結構、強酸性小分子蛋白，其功能與細胞免疫調節、細胞增殖［3］、凋亡有著密切關系.作為一種典型的腫瘤相關蛋白，在細胞增殖和凋亡調控方面的深入研究有助于發現細胞癌變的發生機理，曾在多種癌癥中檢測到了Pro Tα水平的升高［4］；這種在癌細胞中高水平的Pro Tα蛋白產物不僅維持細胞處于高度增殖狀態，還保護細胞避免進入凋亡途徑.體外實驗，在凋亡過程中，Pro Tα被caspase-3切割而發生斷裂［5］，導致核定位信號遭到破壞，進而使斷裂的ProTα從細胞核轉移到胞質和胞外，由于Pro Tα不能在核內積聚而削弱了其核內與增殖相關的功能，這種現象并不見于正常細胞；而且，胞核和胞質定位的Pro Tα衍生物對腫瘤壞死因子誘導的Hela細胞凋亡［6］均有抵抗作用，所以，研究Pro Tα在癌變過程中的定位有助于揭示細胞癌變的發生機理.目前國內外有關移植性肝癌和正常肝組織中Pro Tα水平和定位的研究還未見報道.我們應用本課題組克隆表達的重組人Pro Tα［7］制備了多克隆抗體［8］，采用Western-blot和免疫組織化學的方法對小鼠正常肝組織和腫瘤組織中的Pro Tα進行了分析，其結果將對研究Pro Tα在腫瘤發生和治療中的作用以及腫瘤臨床醫學的診斷預測有重要價值.

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗動物：SPF級昆明小鼠20只，雄性，質量22～30 g，6～8周齡，購自廈門大學實驗動物中心，置于溫度20℃左右，濕度65%左右的室內，以普通小鼠飼料喂養.

肝癌細胞株：小鼠H22腹水型肝癌細胞株由廈門大學實驗動物中心提供，SPF級昆明小鼠傳代.

主要試劑：大鼠抗Pro Tα多克隆抗體均由本實驗室制備；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗大鼠IgG抗體購自美國聯科生物產品，UltraSensitiveTMSP試劑盒、DAB試劑盒購自福州邁新公司.

1.2 方 法

1.2.1 H22實體瘤荷瘤小鼠和移植性肝癌模型制備

無菌條件下將H22腹水腫瘤按1∶8稀釋計數，然后調整濃度為3×107m L￣1，以100μL/只接種，其細胞數為3×106個/只，接于小鼠的前肢腋下，觀察生長情況.當腫瘤長至0.5 cm時，無菌條件下取出腫瘤組織.將組織切細后用手術方法將組織移植到小鼠肝組織中，傷口用醫用生物膠封閉.腫瘤小鼠模型養至7 d，取腫瘤小鼠與正常小鼠的新鮮肝組織用多聚甲醛固定24 h（4℃）.

1.2.2 Western-blot檢測ProTα的表達水平

按文獻［9］提取胞質蛋白的方法提取正常肝組織與肝癌組織細胞中的胞質.提取蛋白后移至離心管，1× 104r/min低溫離心15 min，取上清液用蛋白試劑盒進行濃度測定并平衡，加4×Loading Buffer煮樣10 min進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），再電轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，洗膜3次（每次5 min）后用5%（質量分數）脫脂奶粉封閉1 h，加大鼠抗ProTα抗體（1∶1 000稀釋）4℃過夜，洗膜3次（每次5 min）后，加HRP標記的山羊抗大鼠IgG（1∶2 000稀釋）常溫孵育1 h，洗膜3次（每次5 min，若背景過高，可每次洗5～10 min）后加二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑進行顯色，β微管蛋白（β-Tubulin）作參照，檢測ProTα的表達量.

1.2.3 免疫組織化學法檢測ProTα的表達分布

將存于多聚甲醛中的正常組織與肝癌組織固定24 h后取出，梯度脫水透明后進行包埋、切片、貼片、烤片；將制成的石蠟切片在60℃烘箱烘烤1 h，梯度透明及復水；利用抗原修復液進行抗原修復并洗片，加UltraSensitiveTMSP試劑盒中A試劑（內源性過氧化物酶阻斷劑）10 min后洗片，再加B試劑（正常動物非免疫血清）10 min后洗片，最后加入大鼠抗Pro Tα多克隆抗體（1∶1 000稀釋）4℃過夜，陰性對照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗；次日，洗片后依次加C試劑（生物素標記的第二抗體）、D試劑（鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶）各10 min并洗片后就可以進行染色；用新制備好的DAB試劑進行顯色，蘇木精復染，梯度脫水及透明后，用中性樹脂進行封片.

1.2.4 HE染色法檢測肝組織的形態結構

取肝組織切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后，用蘇木精染色4 min，鹽酸酒精分色30 s，伊紅染色2 min，再一次進行酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干并置于顯微鏡上進行觀察拍照.

2 結 果

2.1 Western-blot法檢測結果

Western-blot實驗結果顯示，Pro Tα在正常肝細胞質中的表達量高（圖1（a）），而在肝癌細胞質中幾乎無表達（圖1（b））.

圖1 Pro Tα在正常肝細胞質（a）和肝癌細胞質（b）中的表達水平（Western-blot）Fig.1 The expression level of ProTαin normal liver（a）and hepatocellular carcinoma tissues（b）by Western-blot

2.2 免疫組織化學法檢測結果

免疫組織化學結果如圖2所示，在正常肝組織中，Pro Tα蛋白的表達主要位于肝細胞的胞質（圖2（a）中白色箭頭），強陽性表達為清晰的棕黃色顆粒，而胞核則為陰性，為蘇木精著色（圖2（a）中黑色箭頭）.正常肝組織的HE染色顯示胞質和胞核的位置（圖2（b）），胞核大小適中，肝索清晰，同時證明在免疫組織化學中顯示陽性部位在胞質而不是胞核；但在肝癌組織中，從HE染色可以看出，癌細胞的細胞核所占細胞比例大，胞質比例明顯減少，肝索紊亂（圖2（e）黑色箭頭為胞核，白色箭頭為胞質）.免疫組織化學結果顯示，肝癌組織中的細胞核顯示強棕色反應，胞質也有部分棕色反應，但與胞核相比明顯弱（圖2（c），黑色箭頭為強陽性胞核，白色箭頭為弱陽性胞質）；而陰性對照組（圖2（d））細胞核并未著色，為蘇木精復染的藍色，胞質比例小，并且免疫組織化學也未見明顯棕色反應.免疫組織化學結果與Westernblot結果一致.

3 討 論

研究顯示，與正常組織對照，一些癌組織中有高水平的Pro Tα表達.Pro Tα作為肝癌［10］、肺癌［11］和神經母細胞瘤［］的標志物用以判斷預后.免疫組織化學研究顯示，Pro Tα在高分化甲狀腺乳頭狀和濾泡狀癌的表達量明顯高于濾泡性腺瘤、甲狀腺腫和正常組織［13］.Pro Tα作為一種核蛋白［］在細胞中的定位及其表達量具有重要的理論和實踐意義，研究表明此蛋白具有一定的可擴散性，是一種穿梭蛋白［15］.本實驗采用移植性肝癌作為正常細胞轉變為肝癌細胞模型，應用Western-blot法及免疫組織化學法對Pro Tα在小鼠正常肝組織與肝癌組織中的表達、分布情況進行了測定.Western-blot結果顯示，當肝組織正常時，Pro Tα分布在胞質中（圖2（a）），而當肝組織轉變為肝癌細胞時，胞質中的Pro Tα迅速減少（圖2（c））；進一步的免疫組織化學定位結果顯示，免疫組織化學強陽性結果在正常肝組織中主要存在于胞質中而胞核中較少（圖2（b）），相反，當細胞癌變后，強陽性結果卻主要集中到細胞核中（圖2（e））.兩種方法檢測結果高度一致，與文獻［15］結果相符.以上實驗證明，在正常肝細胞中Pro Tα主要分布在胞質，當細胞發生癌變之后，肝癌細胞核中Pro Tα的水平明顯升高.此外由正常肝細胞質中Pro Tα高表達可以推測，該蛋白對穩定細胞防止癌變有重要作用，相關機理有待進一步研究.本結果目前只在動物腫瘤中發現，如果應用于人的相應腫瘤進行驗證，證明結果一致，將有利于臨床腫瘤的診斷和預后，并為其提供科學依據.

圖2 免疫組織化學法觀察Pro Tα在肝組織中的表達水平（×40）Fig.2 The expression level of Pro Tαin liver homogenate by immunohistochemical method（×40）

［1］ Ferlay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：Globocan 2008［J］.International Journal of Cancer，2010，127（12）：2893-2917.

［2］ Parkin D M，Bray F，Ferlay J，et al.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000［J］.International Journal of Cancer，2001，94（2）：153-156.

［3］ Pi?eiro A，Cordero O J，Nogueira M.Fifteen years of prothymosin alpha：contradictory past and new horizons［J］. Peptides，2000，21（9）：1433-1446.

［4］ 劉從容，楊京平，王玉平，等.胸腺素β10在人類乳腺癌中的表達［J］.中國腫瘤臨床，2004，31（9）：481-484.

［5］ Enkemann S A，Wang R H，Trumbore M W，et al.Functional discontinuities in prothymosinαcaused by caspase cleavage in apoptotic cells［J］.Journal of Cellular Physiology，2000，182（2）：256-268.

［6］ Shiau A L，Chu C Y，Su W C，et al.Vaccination with the glycoprotein D gene of pseudorabies virus delivered by nonpathogenic Escherichia coli elicits protective immune responses［J］.Vaccine，2001，19（23）：3277-3284.

［7］ 李俊燕，周克夫.胸腺素α原基因的克隆及在大腸桿菌中的融合表達［J］.廈門大學學報：自然科學版，2006，45（5）：722-725.

［8］ 周克夫，楊彩霞，韓偉.抗胸腺素α原多克隆抗體及其制備方法與應用：中國，201110200674.2［P］.2011-07-18［2014-09-22］.

［9］ 羅彥彥，林有坤，黃翠麗，等.肝細胞漿蛋白誘導系統性紅斑狼瘡兔模型的實驗研究［J］.免疫學雜志，2011，27（8）：710-714.

［10］ Wu C G，Habib N A，Mitry R R，et al.Overexpression of hepatic prothymosin alpha，a novel marker for human hepatocellular carcinoma［J］.British Journal of Cancer，1997，76（9）：1199-1204.

［11］ Sasaki H，Nonaka M，Fujii Y，et al.Expression of the prothymosin-αgene as a prognostic factor in lung cancer［J］.Surgery Today，2001，31（10）：936-938.

［12］ Sasaki H，Sato Y，Kondo S，et al.Expression of the prothymosinαm RNA correlated with that of N-myc in neuroblastoma［J］.Cancer Letters，2001，168（2）：191-195.

［13］ Shiwa M，Nishimura Y，Wakatabe R，et al.Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，309（1）：18-25.

［14］ Letsas K P，Frangou-Lazaridis M，Skyrlas A，et al.Transcription factor-mediated proliferation and apoptosis in benign and malignant thyroid lesions［J］.Pathology International，2005，55（11）：694-702.

［15］ Enkemann S A，Ward R D，Berger S L.Mobility within the nucleus and neighboring cytosol is a key feature of prothymosin-α［J］.Journal of Histochemistry＆Cytochemistry，2000，48（10）：1341-1355.

Study on the Localization of Prothymosinαin Normal and Tumor Tissues

CUI Ruo-chen，CAI Bao-wei，SU Jin-hong，HU Xin-yan，SUN Yu-han，GUO Quan，ZHOU Ke-fu*
（College of the Environment＆Ecology，Xiamen University，Xiamen 361102，China）

To study and analyze the expression and distribution of prothymosinα（Pro Tα）in normal and tumor cells of mice，twenty male Kunming mice were randomly divided into normal group and model group.Mice in the model group were inoculated with H22（Hepatoma 22）tumor cell.After 7 days，part of livers of the normal and hepatocellular carcinoma tissues were extracted to make slices for immunohistochemistry test and HE staining of ProTα，while part of tissues were homogenized，and cell lysates were extracted for Western-blot to test the expression level of Pro Tαin normal liver and hepatocellular carcinoma tissues.The results showed that the expression level of Pro Tαin the cytoplasm of normal liver cell was significantly higher than that of hepatocellular carcinoma tissue.Immunohistochemistry showed the strong positive reaction in the cytoplasm of normal tissue，and negative in the nuclei.On the contrary，hepatocellular carcinoma tissue showed strong positive immunoreactivity in the nuclei，but weak positive response in cytoplasm.The results indicated that the distribution of Pro Tαin the normal and tumor tissues was changeable and nuclei translocation of Pro Tαgradually took place during the occurrence and development of hepatocellular carcinoma.These results laid the foundation for the mechanism study of ProTαin tumor occurrence，and would be beneficial to develop diagnosis method of cancer.

prothymosinα；H22cells；hepatocellular carcinoma；localization

R 73

A

0438-0479（2015）04-0474-04

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.04.006

2014-09-22 錄用日期：2015-02-11

福建省自然科學基金（2013J01383）

*通信作者：zhkefu＠xmu.edu.cn

崔若辰，蔡報偉，蘇勁紅，等.胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究［J］.廈門大學學報：自然科學版，2015，54（4）：474-477.

：Cui Ruochen，Cai Baowei，Su Jinhong，et al.Study on the localization of prothymosinαin normal and tumor tissues［J］. Journal of Xiamen University：Natural Science，2015，54（4）：474-477.（in Chinese）