絨毛組織中抑制素A表達與稽留流產的相關性研究*

王小敏，王小燕，楊聯君，韓萍

(深圳市龍崗區第二人民醫院婦科，深圳龍崗518112)

絨毛組織中抑制素A表達與稽留流產的相關性研究*

王小敏，王小燕，楊聯君，韓萍

(深圳市龍崗區第二人民醫院婦科，深圳龍崗518112)

目的研究抑制素A在早期正常妊娠、稽留流產患者絨毛中的定位及表達水平，探討抑制素A與稽留流產的相關性。方法選取2012年8月至2013年10月期間自愿在我院婦科終止妊娠的80例患者，其中20例正常早孕要求人工流產者為對照組，稽留流產60例，后者根據胚胎停止發育至排出母體外的時間，分成A組(＜2周)，B組(2～4周)以及C組(＞4周)(n=20)。采用免疫組織化學技術和計算機圖像分析系統，檢測絨毛組織中抑制素A表達情況。結果抑制素A在對照組、稽留流產組絨毛的合體滋養細胞、細胞滋養細胞、毛細血管內皮細胞的胞漿呈不同程度的陽性染色。稽留流產組絨毛抑制素A的表達水平明顯低于對照組(P＜0.05)，但A、B、C 3組間表達無統計學意義(P＞0.05)。結論絨毛組織中抑制素A對于正常早期妊娠的維持起重要作用，抑制素A表達水平降低可能在稽留流產發生過程中具有重要作用。

抑制素A;稽留流產;絨毛組織

抑制素A屬于轉化生長因子－β(transformation growth factor－β，TGF－β)的超家族成員，妊娠期主要來源于胎盤的分泌。近年來研究發現，抑制素A在母體正常表達對妊娠的維持和發展起重要作用［1］。本文通過研究稽留流產和正常早孕患者絨毛組織中抑制素A的表達，探討其與稽留流產的相關性，為稽留流產病因的深入研究和臨床防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象選取2012年8月至2013年10月期間自愿在深圳市龍崗區第二人民醫院婦科終止妊娠的80例患者，其中20例自愿要求行人工流產的正常早孕患者為對照組，稽留流產患者60例為病例組，行清宮術，其診斷標準參照人民衛生出版社《婦產科學》第8版［2］。按照胚胎停止發育至排出母體外的時間，將觀察組再分成A組(＜2周)，B組(2～4周)以及C組(＞4周)3組，每組20例。患者年齡20～40歲，孕次1～4次，產次0～3次，均為單胎，孕周6～12+6周，各組差異均無統計學意義(P＞0.05)。本次孕期無特殊用藥史，無放射線及化學物質接觸史，無生殖器畸形和感染性疾病，無妊娠并發癥及合并癥。

1.1.2 標本收集將絨毛置于生理鹽水中漂洗2次后，置于中性甲醛固定液中固定24～48h，酒精梯度脫水，經二甲苯透明后，石蠟包埋，各制備4μm切片備用。

1.1.3 主要試劑一抗:兔抗人多克隆抗體(抑制素A)，二抗:生物素標記的羊抗兔IgG、辣根酶標記的鏈酶親和素、DAB顯色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法抑制素A蛋白的檢測按相應操作步驟，參照說明書進行。試劑盒提供陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。實驗步驟如下:60℃烤片2h;二甲苯脫蠟15min，3次;依次經過無水乙醇、95%、90%、80%、70%的乙醇，各5min，蒸餾水5min水化;PBS洗5min，3次;枸櫞酸緩沖液(約92℃～95℃)煮沸抗原修復15min，自然涼至室溫。PBS洗5min，3次;3%雙氧水封閉20min，PBS洗5min，3次;正常山羊血清封閉，37℃20min;一抗孵育，4℃過夜;復溫20min，PBS洗5min，3次;二抗孵育37℃20min，PBS洗5min， 3次;三抗孵育37℃20min;PBS洗5min，3次; DAB顯色，鏡下觀察結果，適時終止;蘇木素復染5min，自來水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精(75%)溶液分化30s，自來水沖洗5min藍化;依次經過70%、80%、90%、95%、無水乙醇脫水，各5min，二甲苯15min，3次;封片，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.2 結果判定以滋養細胞胞漿出現棕黃色顆粒，染色明顯高于背景為陽性，采用圖像分析軟件Olympus CellSens Dimension對其進行定量分析，每張切片放大200倍后隨機取10個不重疊的視野，以平均光密度(optical density，OD)代表抑制素A著色強度。

1.3 統計學處理計量資料均以ˉx±s的形式表示，用SPSS 17.0對數據進行統計學處理，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學顯著意義。

2 結果

2.1 抑制素A在各組絨毛中的表達定位免疫組化結果顯示，在陰性對照片中，絨毛滋養細胞胞漿中未見棕黃色顆粒，無陽性染色，見圖1A。對照組絨毛的合體滋養細胞、細胞滋養細胞、毛細血管內皮細胞的胞漿均呈陽性染色，位于絨毛最外層的合體滋養細胞和其內層的細胞滋養細胞陽性染色最強，血管內皮細胞次之，絨毛間質無陽性染色，見圖1B。抑制素A在稽留流產組絨毛中的表達定位與對照組相一致，但染色程度明顯低于對照組，以A組為代表，見圖1C。

圖1 免疫組化法檢測抑制素A在絨毛中的表達

2.2 抑制素A在各組絨毛中的表達水平定量分析表明，與對照組相比，抑制素A在稽留流產組的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。稽留流產組按照胚胎停止發育至排出母體外的時間長短不同分成3組，A、B、C 3組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 抑制素A在各組絨毛中的表達(OD值，ˉx±s)

3 討論

抑制素與女性生殖內分泌關系密切，其中抑制素A是整個妊娠過程中抑制素的主要存在形式，在妊娠期的內分泌調節中發揮了更重要的作用［3］。妊娠早期，抑制素A在子宮內膜蛻膜化、免疫耐受、種植準備、胚胎及滋養細胞的種植和分化中起重要調節作用，調控滋養層細胞侵入子宮蛻膜，使子宮內膜形成胎盤的母體部分［4，5］。抑制素A的水平是維持正常早期妊娠的必要條件［5，6］。國內外研究認為，胎盤組織分泌的抑制素A既可以分泌入母體血液循環，也可以分泌入胎兒血液循環，起到調節妊娠期母體促性腺激素釋放、雌孕激素的分泌和胎兒的生長發育的作用;同時又能夠以旁分泌或自分泌方式參與胎盤局部調節軸中促性腺激素釋放激素、人絨毛膜促性腺激素、雌孕激素等各種激素之間的生殖內分泌調節，從而影響著妊娠的發生、發展及胎兒的生長發育［7］。

稽留流產是自然流產的一種特殊類型，一直來也是優生優育領域重要的研究課題。林春麗等［8，9］研究發現稽留流產組血清抑制素A水平低于正常妊娠組，提示抑制素A對稽留流產的診斷和預測具有一定價值，但對于其在胎盤絨毛組織中的表達研究不多。通過研究，我們發現抑制素A在稽留流產和對照組絨毛的合體滋養細胞、細胞滋養細胞、毛細血管內皮細胞的胞漿均呈陽性染色，位于絨毛最外層的合體滋養細胞和其內層的細胞滋養細胞陽性染色最強，血管內皮細胞次之，絨毛間質無陽性染色，與張鈺等［3］的研究結果一致。但Kondi［10］等發現早孕期抑制素A表達在合體滋養細胞和中間滋養細胞及細胞滋養細胞卻不表達，分析原因可能與不同研究所采用抑制素A抗體所針對抗原決定簇的特異性不同有關。

此外，我們研究發現抑制素A在稽留流產及正常早期妊娠絨毛中均有一定程度表達，稽留流產中的表達明顯低于正常早孕組，差異有統計學意義(P＜0.05)，但胚胎停止發育后滯留母體內的時間長短對抑制素A表達水平無明顯影響(P＞0. 05)，可能與其半衰期短(45min)有關系，說明抑制素A水平下降與稽留流產的發生密切相關，同時也提示抑制素A可作為一個早期發現稽留流產的臨床生化指標，為稽留流產的早期診斷提供了新思路。

我們推測，由于胎盤絨毛合成抑制素A能力降低，一方面可能引起妊娠期母體激素分泌、物質代謝紊亂，另一方面還可能引起胎盤局部激素、細胞因子等內環境發生變化，使胎盤局部調節軸中人絨毛膜促性腺激素、雌孕激素等各種激素合成釋放紊亂，導致滋養細胞的侵蝕能力降低，胎盤淺著床，同時還影響滋養層細胞的分化、胚泡植入，影響胚胎的生長發育，最終導致胚胎停止發育，發生稽留流產。

綜上所述，抑制素A水平下降與稽留流產的發生密切相關，為臨床早期診斷和防治稽留流產的發生提供了理論依據和新思路，然而抑制素A對生殖過程的精細調節有待進一步研究。

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［2］謝幸，茍文麗.婦產科學［M］.第8版.北京:人民衛生出版社，2013:49

［3］張鈺，楊玉健，李奕.不同妊娠時期胎盤抑制素、激活素和卵泡抑素在胎盤絨毛中表達的臨床觀察［J］.中國計劃生育學雜志，2007，16(3):161

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［5］Florio P，Gabbanini M，Borges LE，et al.Activins and related proteins in the establishment of pregnancy［J］.Reprod Sci，2010，17(4):320

［6］Phupong V，Hanprasertpong T.First trimester serum inhibin A in normal pregnant women［J］.Arch Gynecol obstet，2008，277(4):307

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［10］Kondi－Pafiti A，Grigoriadis C，Samiotaki D，et al.Immunohistochemical study of inhibin A and B expression in placentas from normal and pathological gestations［J］.Clin Exp Obstet Gynecol，2013，40(1):109

Expression of Inhibin A in the Villi of Missed Abortion

WANG Xiao－min，WANG Xiao－yan，YANG Lian－jun，et al
(Department of Gynecology，The Second People＇s Hospital of Longgang District，Shenzhen Guangzhou 518112，China)

ObjectiveTo study the expression of inhibin A in the villi of patients with normal early pregnancy and missed abortion，and the correlation between inhibin A and missed abortion.Methods80 patients registered to the Department of Gynecology in our hospital between August 2012 and October 2013 were collected.20 cases of normal early pregnancy with artificial abortion were served as control group.60 cases of missed abortion were divided into three groups according to the time between embryo death and removal from pregnant women:Group A(≤2weeks)，Group B(2～4weeks)and Group C(≥4weeks)(n=20).The expression of inhibin A was determined by immunohistochemistry technology and computer image analysis systems.ResultsInhibin A exhibited positive staining at the cytoplasm of syncytiotrophoblast，cytotrophoblast and capillary endothelial cell of villi.The expression of inhibin A in the villi of the missed abortion group was less than that in the control group(P＜0.05).There were no significant differences of inhibin A expression in villi among groupA，B and C(P＞0.05).ConclusionInhibin A from villi plays an important role in sustaining normal early pregnancy. The low expression of inhibin A may play an important role in the process of missed abortion.

Inhibin A;Missed abortion;Villi

R714.2

A

2095－4646(2015)01－0016－03

2014－12－01)

深圳市龍崗區科技創新局資助項目(YS2011073)