大鼠左全肺切除促進肺血管重塑

許果，趙興吉，向小勇，王繼相，佘凱

(1.四川綿陽四0四醫院胸心外科，四川 綿陽 621000;2.重慶市急救醫療中心胸心外科，重慶 400014;3.重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科，重慶 400016)

肺切除是臨床上治療肺部疾病的一種重要手段，隨著肺癌和肺結核發病率的增加，以及治療手段的進步，全肺切除的比例有所增加［1，2］。現有關全肺切除的研究主要是圍手術期處理，對術后遠期療效的評價缺乏病理學依據。本實驗通過切除大鼠左全肺建立動物模型，以模擬臨床全肺切除術后的病理生理改變，了解遠期是否發生肺血管重塑和肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，探討肺血管重塑可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性 SD大鼠24只，2～3月齡，體重(248±26)g，購自重慶醫科大學實驗動物中心［SCXK(渝)2007－0001］。實驗場地由重慶醫科大學實驗動物中心提供［SYXK(渝)2007－0001］。隨機分為2組:實驗組12只，行左全肺切除;對照組12只，行假手術。術后飼養l2周。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，行氣管切開，置入自制氣管導管，接小動物呼吸機。沿左胸第五肋間進入胸腔，切除左全肺。對照組麻醉同前，切口至壁層胸膜后，保持其完整，不入胸腔，縫合切口。

1.2.2 肺動脈壓力測定

采用右心導管法測定平均肺動脈壓(mPAP)。

1.2.3 動脈血氧分壓(PaO2)測定

從左心室抽血，用于測定PaO2。

1.2.4 電鏡標本制備及觀察

切除右肺，從外周部位及肺門水平切取2～3塊1～2 mm組織塊，處理后在電鏡下觀察肺腺泡內動脈內皮細胞和平滑肌細胞的大小、形態、排列形式、細胞內部結構的變化、表型的轉化等。

1.2.5 光鏡標本制備及觀察

肺組織標本用4%中性甲醛固定，用石蠟包埋，沿右肺門橫斷取材，分別作HE及免疫組化染色。

(1)三型肺小血管不同肌化程度百分比的測定:在400倍光鏡下，觀察并計數肺小血管(15 μm＜直徑≤200 μm)中肌型動脈(muscularized artery，MA)、部分肌型動脈(partially muscularized artery，PMA)及非肌型動脈(non－muscularized artery，NMA)的數目，分別計算它們各占肺小血管總數的百分比，反映肺小血管的肌化程度。每例標本觀測10個血管。

(2)肺中、小型動脈相對中膜厚度及面積的測定:應用Mias圖像分析系統測取動脈外徑、中膜厚度(media thickness of vessel，MTV)、血管總面積及中膜面積(media area of vessel，MAV)，分別計算中膜厚度與動脈外徑的比值(MTV%)，中膜面積與血管總面積的比值(MAV%)，作為肺血管重塑的指標。每只大鼠各測量10個肺中型動脈(100 μm ＜直徑≤200 μm)和肺小型動脈(15 μm ＜直徑≤100 μm)上述各值，并求其均值。

1.2.6 肺組織免疫組織化學染色SABC法

操作按試劑盒說明進行。

1.2.7 圖像分析

對免疫組織化學染色強度進行測量，每張切片均測量其背景灰度，以消除切片間的誤差。用Image－Pro Plus圖像分析系統心肺血管分析軟件測取所選血管管壁陽性染色積分光密度(integrated optical density，IOD)作為肺動脈管壁 VEGF和 HIF－1α的相對含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。實驗數據以均數±標準差()表示，統計方法采用獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，Pearson檢驗進行直線相關分析。檢驗水準α =0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 平均肺動脈壓與動脈血氧分壓的比較

實驗組mPAP(31.91±1.98 mmHg)明顯高于對照組(17.82±1.94 mmHg)，PaO2(77.46±5.36 mmHg)明顯低于對照組(90.39±6.02 mmHg)，(P＜0.01)。

2.2 三型肺小血管不同肌化程度百分比的比較

實驗組肺小血管中MA%和PMA%(22.50±4.52，23.33±4.92)明顯高于對照組(13.33±4.92，14.17±5.15)(P＜0.01)，NMA%(54.17±5.15)明顯低于對照組(72.50±7.54)(P＜0.01)。

2.3 肺小血管結構改變

HE染色顯示對照組的肺小血管管壁較薄，內膜光滑，管腔較大，平滑肌細胞走行一致(圖1)。而實驗組肺小血管收縮，管壁增厚，管腔狹窄、肺血管平滑肌細胞異常增殖(圖2)。圖像分析表明，實驗組大鼠肺中、小型動脈 MTV、MAV、MTV%和MAV%明顯高于對照組(P＜0.01)(表1、2)。

2.4 肺腺泡內動脈超微結構的變化

電鏡觀察到對照組肺動脈內皮細胞胞體扁平，細胞器結構正常。實驗組肺動脈內皮細胞體積增大，基底變窄，呈柱狀突入管腔，細胞器豐富，甚至見內皮細胞腫脹，胞質內大量空泡形成。對照組中膜平滑肌細胞胞體小，平滑肌細胞呈收縮表型。實驗組中膜平滑肌細胞數量增多，胞體肥大，細胞器增多，不同程度向合成表型轉化。平滑肌細胞間及肺間質見膠原纖維密集，細胞外基質增多(圖3～5)。

2.5 肺小血管壁VEGF與HIF-1α的表達

經灰度掃描，實驗組肺動脈壁VEGF及HIF－1α的IOD值(42.04±3.79，26.47±4.16)明顯高于對照組(11.53±2.29，6.12±2.14)(P ＜0.01)。相關分析表明，VEGF及 HIF－1α陽性染色強度與 PaO2呈負相關(r= －0.734，r= －0.712)(P ＜0.01)，與肺小動脈MTV%(r=0.672，r=0.657)(P＜0.05)及MAV%(r=0.718，r=0.684)(P ＜ 0.01，P ＜0.05)呈正相關，HIF－1α與VEGF的陽性染色強度呈正相關(r=0.627)(P＜0.05)。

表1 實驗組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

表1 實驗組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

?

表2 實驗組和對照組大鼠肺小動脈外經、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

表2 實驗組和對照組大鼠肺小動脈外經、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

?

3 討論

3.1 PH動物模型的建立及評價

導致PH的病因復雜多樣，既往許多學者用多種動物和不同的方法建立過PH動物模型，以模擬不同的發病因素。如利用大動物建立體－肺分流［3－5］，經頸部動靜脈血管吻合，用探針穿破主動脈－下腔靜脈［6］，給大鼠注射野百合堿(monocrotaline，MCT)，導致肺血管內皮損傷，從而形成 PH［7］，以及降低氧濃度來誘發PH［8］等。這些模型都存在不同的局限性，并且不能模擬外科全肺切除后病人的病理生理改變。

圖1 對照組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.1 A small pulmonary artery of a control rat.HE staining，×100

圖2 實驗組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.2 A small pulmonary artery of an experimental rat.HE staining，×100

圖3 對照組:肺血管內皮細胞胞體扁平，結構正常(×8000)Fig.3 Control group:endothelial cells of the pulmonary artery are flat，the structures are normal. ×8000

圖4 實驗組:肺腺泡內動脈內皮細胞呈高柱狀，突入管腔(×8000)Fig.4 Experimental group:endothelial cells of an intra－alveolar pulmonary artery are cubic. ×8000

圖5 實驗組:間質膠原纖維堆積(×5000)Fig.5 Experimental group:increase of interstitial collagen fibers.×5000

我們采取左全肺切除方法建立的動物模型，術后12周測得mPAP明顯升高，表明PH動物模型建立成功。光鏡和電鏡檢查下的病理改變導致肺血管橫截面積顯著增加，肺循環阻力持續升高，與文獻報道的肺動脈高壓組織學改變是一致的，表明實驗動脈發生了肺血管重塑，導致PH行成。

在該模型中，除行肺切除外，未施加其他干預措施，觀察時間較長，能較準確地模擬臨床全肺切除術后的病理生理改變。由于大鼠體積小、價格低廉，該方法手術操作簡單，不需吻合血管，單人肉眼即可完成，也不需要顯微鏡等特殊器械，避免了許多精細復雜的操作和吻合口出血、梗阻、狹窄等主要并發癥，手術過程相對簡單，動物存活率高，實驗重復性好。因此，本模型在PH的研究中有應用價值，為進一步研究肺血管重塑和PH的發病機制進而探索干預途徑提供了實驗平臺。

3.2 HIF-1α與VEGF在肺血管重建中的作用

HIF－l是一種轉錄因子，由α和β兩個蛋白亞基組成，HIF－1α多肽鏈是惟一的氧調節亞單位，它決定HIF－1的活性。HIF－1α是細胞最早感受缺氧刺激的因子之一。常氧條件下HIF－1無DNA結合活性，而在低氧條件下其表達顯著升高［9，10］。本研究中檢測到實驗組大鼠存在慢性低氧血癥，在其肺動脈內皮細胞，平滑肌細胞和支氣管內皮細胞等處有明顯的HIF－1α免疫陽性表達。說明由于大鼠左肺切除導致的低氧血癥刺激誘導了肺內HIF－1α表達增加。HIF－1α可誘導大量與低氧應答有關的下游目的基因的表達，如 VEGF、EPO、iNOS 等［11，12］。在這些細胞因子作用下，血管平滑肌細胞(PASMC)大量增殖，使血管中膜增厚和非肌性血管肌化，血管腔變窄，同時PASMC合成分泌的細胞外基質增多，使肺血管彈性回縮力和順應性降低，血流阻力增加，促進PH形成［13，14］。這與本研究中觀察到的病理改變是一致的。

VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，肺是體內VEGF最大的來源。VEGF的主要生物學功能是與血管內皮細胞表面的特異性受體結合而促進成纖維細胞、內皮細胞的生長，合成和分泌膠原等細胞外基質［15］。近年還發現其增強血管尤其是微小血管的滲透性，使纖維蛋白原等大分子血漿蛋白外滲沉積在血管外的基質中。

VEGF基因表達受多種細胞因子調控，其中低氧導致的VEGF表達主要是通過HIF－1實現的［16］。在低氧情況下，HIF－1增加了VEGF的轉錄、表達和VEGF mRNA的穩定性。低氧刺激還引起血管內皮細胞膜上與VEGF結合的受體表達明顯增多，從而增加VEGF的生物效應［17］。在本研究中可見到低氧條件下EVGF在實驗組大鼠肺動脈壁、肺間質等處明顯的免疫陽性表達。而重要的是，HIF－1α與VEGF的陽性表達呈正相關。

結合本研究我們發現，低氧血癥是大鼠左全肺切除后肺血管重建的重要因素。當低氧刺激通過血流到達血管壁時，引起血管內皮細胞和平滑肌細胞的分泌功能和細胞骨架的改變，誘導合成和分泌HIF－1α 及VEGF 增加，通過 HIF－1α－VEGF 途徑參與了低氧性肺血管重建過程。

［1］張德超，毛友生，黃國俊.中國肺癌外科治療概況與進展［J］.中國肺癌雜志，2005，8(6):557－562.

［2］Owen RM，Force SD，Pickens A，et al.Pneumonectomy for benign disease:analysis of the early and late outcomes［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2013，43:312－317.

［3］Michel RP，Hakim TS，Hanson RE，et al.Distribution of lung vascular resistance after chronic systemic to pulmonary shunts［J］.Am J Physiol，1985，249:H1106 － H1113.

［4］Reddy VM，Meyrick B，Wong J，et al.In utero placement of aortopulmonary shunts:a model of postnatal pulmonary hypertension with increased pulmonary blood flow in lambs［J］.Circulation，1995，92(3):606－613.

［5］Miyamoto T，Takeishi Y，Shishido T，et al.Role of nitric oxide in progression of cardiovascular remodeling induced by carotid arterio－venous shunt in rabbits［J］.Jpn Heart J，2003，44(1):127－137.

［6］劉斌，王獻民，魏麗，等.4種肺動脈高壓動物模型肺血管重構模式的差異研究［J］.中國病理生理雜志，2008，24(2):289－193.

［7］陳瑞芬，周光德，曹文軍，等.野百合堿誘導實驗性肺動脈高壓病理形態觀察［J］.電子顯微學報，2002，21(1):45－54.

［8］劉銀花，楊漢文，王小同，等.羥胺對慢性低氧高二氧化碳大鼠肺動脈高壓的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(11):2171－2174.

［9］王蘋蘋，孔繁平，陳學群，等.低氧細胞應激的HIF－1信號通路［J］］.浙江大學學報(醫學版)，2011，40(5):559－566.

［10］Palmer LA，Semenza GL，Stoler MH，et al.Hypoxia induces type II NOS gene expression in pulmonary artery endothelial cells via HIF－l［J］.Am J Physiol，l998，274(2 Pt 1):L2l2 － L2l9.

［11］Hu R，Dai A，Tan S.Hypoxia－inducible factor 1 alpha upregulates the expression of inducible nitric oxide synthase gene in pulmonary arteries of hypoxic rat［J］.Chin Med J，2002，115(12):1833－1837.

［12］Manalo DJ，Rowan A，Lavoie T，et al.Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF－l［J］.Blood，2005，105(2):659－669.

［13］陳建波.王虹.肺血管重塑與低氧性肺動脈高壓［J］.國際呼吸雜志，2008，28(l5):936－939.

［14］王關嵩，錢桂生，陳維中.缺氧對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的效應［J］.心肺血管病雜志，2000，l9(2):l4l.

［15］Leung DW，Cachianes G，Kuang WJ，et al.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen ［J］.Science，1989，246(4935):1306－1309.

［16］Liu Y，Cox SR，Morita T，et al.Hypoxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cells:identification of a 5’enhancer［J］.Circ Res，1995，77(3):638 －643.

［17］Levy AP，Levy NS，Goldberg MA.Post－transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia［J］.J Biol Chem，1996，271(5):2746－2753.