烏骨藤多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

樊丹怡　常宏　蔣紹艷　鄧少潔　何珊

【摘 要】 目的：研究烏骨藤多糖的抗腫瘤活性及可能機(jī)制。方法：腹腔注射給予S180荷瘤小鼠模型低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量的烏骨藤多糖，考察其對荷瘤小鼠抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL-2及TNF-α水平的影響。結(jié)果：與模型組比較，各給藥組均可顯著抑制腫瘤生長（P<0.01），同時，可以明顯增加脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL-2及TNF-α水平（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：烏骨藤多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 烏骨藤多糖；抗腫瘤；免疫功能

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）13-0012-02

惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在許多地區(qū)和國家均高居首位，嚴(yán)重威脅人類健康和生命，而現(xiàn)有的放療、化療等治療手段均不能令人滿意，其中化療藥物具有耐藥性、毒副作用大等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響臨床效果[1]。因此，尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物就顯得極為迫切。烏骨藤為蘿藦科植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima （Roxb.） Wightet Am.的藤莖，始載于《滇南本草》，主產(chǎn)于貴州、云南等地[2]。烏骨藤復(fù)方制劑及其單味藥材制成的片劑、注射劑等已經(jīng)應(yīng)用在直腸癌、胃癌、肺癌、食道癌等惡性腫瘤的治療中，取得較好效果[3-4]。但迄今為止，烏骨藤的抗腫瘤活性成分尚不明確，其研究主要集中在三萜類、甾體苷類等成分，關(guān)于烏骨藤多糖活性研究方面的報道較少[5]。本研究擬通過提取、分離制得烏骨藤多糖，然后通過給予S180荷瘤小鼠烏骨藤多糖30 d后，探討其是否具有抗腫瘤作用及可能的抗腫瘤機(jī)制，為研究和開發(fā)以烏骨藤多糖為主要成分的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及瘤株 昆明種小鼠，健康清潔級，雌雄各半，體重為（20±2） g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；S180肉瘤購自美國ATCC細(xì)胞庫，并定期腹腔接種傳代保存。

1.2 藥品與試劑 烏骨藤購自本地藥材市場，經(jīng)鑒定為蘿藦科植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima （Roxb.） Wightet Am.的藤莖；環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；白細(xì)胞介素-2（IL-2）檢測試劑盒和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒購自南京建成生物。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Elx800型酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；5417R型超高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；AL204型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；2100型紫外分光光度計，美國Unico公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 烏骨藤多糖的提取、分離 烏骨藤經(jīng)蒸餾水洗凈后烘干，粉碎過40目篩，用70%乙醇滲漉；加30倍蒸餾水煎煮3次，每次1h，過濾后合并濾液；濾液加熱濃縮至原體積的1/5，加活性炭脫色，過濾；濾液中加適量預(yù)冷的95%乙醇，使其終濃度為70%，放置過夜析出沉淀；離心后得沉淀，沉淀用少量蒸餾水溶解，濾去不容物后，再加入適量95%乙醇進(jìn)行二次沉淀，沉淀物干燥后得烏骨藤多糖；采用苯酚-硫酸法測烏骨藤多糖含量。

2.1.2 荷瘤小鼠模型的建立、分組及給藥 60只昆明種小鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型組、環(huán)磷酰胺組（20mg/kg）、烏骨藤多糖低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量組。按文獻(xiàn)[6]方法，在無菌條件，取接種7d后生長良好的S180腫瘤細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)成2×106個/ml的細(xì)胞懸液，除正常對照組外，各組小鼠右前肢接種0.2 ml。接種24h后給藥，環(huán)磷酰胺組ip給藥，隔天1次；烏骨藤多糖組ip給藥，每天1次；正常對照組及模型組ip等體積的生理鹽水，給藥周期為30 d。

2.1.3 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 末次給藥后次日稱量小鼠體重，眼球取血后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟和胸腺，計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，公式如下：

2.1.4 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響 將2.1.3中取得的血樣離心后，分離血清，然后按照試劑盒說明書中操作步驟檢測荷瘤小鼠血清中IL-2和TNF-α的水平。

2.1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用（x±s）表示連續(xù)變量，采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 烏骨藤多糖的提取、分離 制得的烏骨藤多糖為淺灰色粉末，其提取率為5.1%（相對于被提取的烏骨藤干重），純度為87.6%。

2.2.2 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 與模型組比較，烏骨藤多糖低、中、高劑量給藥組的腫瘤質(zhì)量均明顯減輕（P<0.01），表明其具有顯著的抗腫瘤作用，低、中、高劑量組的抑瘤率分別為22.45%、32.65%和34.69%；同時，與模型組相比，烏骨藤多糖各給藥組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.05或P<0.01），而環(huán)磷酰胺組中此2項(xiàng)指標(biāo)則明顯降低（P<0.05或P<0.01），提示烏骨藤多糖的毒副作用要明顯小于環(huán)磷酰胺。

2.2.3 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響 與模型組相比，烏骨藤多糖中、高劑量組的IL-2水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），而低劑量組雖然有一定程度增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組相比，烏骨藤多糖低、中、高劑量組的TNF-α水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且具有劑量依賴關(guān)系，以上結(jié)果提示烏骨藤多糖的抗腫瘤作用可能是通過提高免疫功能而起作用。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏骨藤多糖可不同程度的抑制S180肉瘤的增長，但是抑瘤效果要低于陽性藥物環(huán)磷酰胺；但環(huán)磷酰胺在起到抗腫瘤作用的同時，可以明顯降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明其具有較大的毒副作用；而烏骨藤多糖可以增加荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明烏骨藤多糖毒副作用較小。新藥的研究開發(fā)要以安全、有效為準(zhǔn)則，其中安全性更為重要[7]。因此，烏骨藤多糖在臨床應(yīng)用方面將會具有較好的前景。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程極為復(fù)雜，目前為止，并沒有完全闡述清楚；但多項(xiàng)研究表明，免疫功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。機(jī)體的免疫功能主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫，尤其是細(xì)胞免疫在清除腫瘤過程中起著主導(dǎo)作用。IL-2和TNF-α為評價機(jī)體細(xì)胞免疫水平的重要指標(biāo)，在腫瘤的免疫治療中受到越來越廣泛的重視。多項(xiàng)研究表明，植物多糖除了具有對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用外，還可以通過促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)而間接發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[9-10]。本研究通過給予荷瘤小鼠不同劑量的烏骨藤多糖后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，低、中、高劑量的烏骨藤多糖均可以增加荷瘤小鼠血清IL-2水平，其中中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；同時，與模型組比較，各劑量組的烏骨藤多糖也可以顯著增加荷瘤小鼠血清TNF-α水平（P<0.05或P<0.01）。因此，可以推測烏骨藤多糖可以通過促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生，增加機(jī)體免疫能力，從而起到抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上所述，烏骨藤多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

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（收稿日期：2015.05.19）