軟骨細胞復合纖維蛋白膠植入修復兔關節軟骨缺損的效果研究

張桂友　林宇雨　楊戈　聶建雄　譚享業　賈春媛　許朋　黃菊蘭

【摘要】 目的：觀察軟骨細胞復合纖維蛋白膠植入修復兔關節軟骨缺損的效果。方法：用硫酸銨沉淀法從兔血液中提取纖維蛋白并且制備纖維蛋白膠；建立兔關節軟骨缺損模型，編號，將40只新西蘭兔分為實驗組及空白對照組，實驗組植入復合物，空白對照組不進行任何植入處理。分別于術后4、8、12周取材料，進行大體、甲苯胺藍以及組織學的觀察，判斷關節軟骨細胞缺損的修復情況。結果：實驗組實驗12周時可以修復膝關節軟骨的缺失，以透明的軟骨組織為主，修復效果明顯優于空白對照組。結論：軟骨細胞復合纖維蛋白可以很好地修復關節軟骨的缺損，可以考慮用于再生修復軟骨的缺損。

【關鍵詞】 纖維蛋白膠； 軟骨缺損； 硫酸銨沉淀

【Abstract】 Objective：To observe the effect of the compound fibrin glue on repairing articular cartilage defect of rabbit.Method：The fibrin was extracted from rabbit blood by ammonium sulfate precipitation method and prepared fibrin glue.The defect model of rabbit articular cartilage was established，then numbered.The 40 New Zealand rabbits were divided into the experimental group and the blank control group，the experimental group was implanted composite，the blank control group without any implant treatment.The materials were taken respectively after 4，8，12 weeks，underwent the generally，toluidine blue staining and histological observation，the repair of articular cartilage defect was judged.Result：In the experimental group，the defect of the articular cartilage was repaired at 12 weeks，and the tissue of the cartilage was transparent，and the effect of the repair was better than that of the blank control group.Conclusion：Chondrocytes complex fibrin can be a good repair for articular cartilage defects，can be considered for the regeneration of cartilage defects.

【Key words】 Fibrin glue； Cartilage defects； Ammonium sulfate precipitation

First-authors address： Zhongshan Sanxiang Hospital， Zhongshan 528463， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.006

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關節軟骨缺損主要是由機械外傷或者炎癥等原因造成，據研究數據顯示關節軟骨缺損的臨床發生率大概為5%左右[1]。早在1968年Chestenman等[2]已經報道采用軟骨細胞來修復關節軟骨。為了能夠使得植入的細胞很好地固定于關節軟骨缺損處，需要一個比較合乎要求的移植載體。傳統的載體選擇一般都為商品化的人纖維蛋白膠，但是在美國考慮疾病的傳播而被限制使用。硫酸銨沉淀法是比較簡便的一種制備纖維蛋白原的方法，并且可以避免疾病傳播。筆者在查閱相關文獻時發現目前采用該方法制備纖維蛋白膠修復關節軟骨缺損的報道較少，因此決定采用自體的軟骨細胞符合纖維蛋白修復兔關節缺損，并收到比較理想實驗結果，現將實驗整理作如下報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 凝血酶原購自杭州康恩貝公司，氯化鈣以及枸櫞酸鈉為分析純，40只新西蘭兔購自上海醫藥工業研究所，體重范圍2～3 kg，雌雄部分，隨機分為實驗組以及空白對照組，其余的藥品參考綦惠等[3]報道中所用試劑。

1.2 方法

1.2.1 自體軟骨細胞的分析和培養 對實驗組的兔子進行編號，采用3%的異戊巴比妥經耳緣進行麻醉，在無菌的條件下削取右側股骨滑車的關節軟骨。

1.2.2 制備生物膠原蛋白 用A、B兩種液體混合而成。凝血酶、Ca2+為A液主要成分，其中含有400 IU/mL的凝血酶和40 mmol/L的Ca2+。纖維蛋白、XⅢ因子是B液主要成分，含有60 g/L的纖維蛋白原以及30 U/mL的XⅢ因子。軟骨細胞和纖維蛋白復合參考文獻[4]的報道。

1.2.3 分離軟骨細胞 取實驗兔的膝關節股骨髁軟骨組織。將其剪成塊狀，PBS沖洗，剪碎，離心，加入2% Ⅱ型膠原酶溶液，然后37 ℃、5% CO飽和溶液培育3 h，然后800 r/min，離心5 min，收集離心后的細胞、再用PBS沖洗3次。

1.2.4 模型制備 將大兔仰臥于手術臺，3%的異戊巴比妥經耳緣進行麻醉，切口在膝外側，在股骨外側的髁關節面進行抽取軟骨，直徑為3 mm缺損做在關節平面，縱向鉆入3 mm，直達骨髓腔。

1.2.5 分組 將已經編號的40只大兔分為實驗組和對照組。實驗組兔膝關節軟骨缺損區植入含有軟骨細胞和纖維蛋白復合物，空白對照組不做任何植入處理。分別在第4、8、12周進行處死取材，用10%體積分數的甲醛固定，30%甲酸脫鈣，石蠟進行包埋然后制備成4 μm的切片。

1.3 觀察項目 蘇木精-伊紅染色和大體實驗觀察修復組織學的效果，用甲苯胺藍染色觀察修復后透明軟骨形成情況。

2 結果

2.1 實驗觀察情況 所用實驗兔膝關節活動正常，關節無粘連現象、沒有發現滑膜增生和關節游離，顯示關節液清亮。實驗組4～8周，半透明、軟骨樣組織替代缺損，并且邊界模糊，表面光滑。對照組4～8周發現色澤比較灰暗，表面出現凹凸不平，在12周時出現蟲蝕樣，創面邊界模糊不清。

2.2 組織學結果 造模12周后用蘇木精-伊紅對兩組切片進行染色，結果實驗組修復的組織透明，軟骨厚度接近正常，與周圍軟骨結合較完好，有梭型纖維樣的細胞在表層出現，軟骨有陷窩，深層的軟骨已經出現鈣化和底層的軟骨緊密結合。對照組缺損的軟骨部位只生成少量纖維組織，經過修復的地方比較薄。

2.3 甲苯胺藍染色情況 造模12周后對兩組切片進行甲苯胺藍染色。實驗組染色為陽性，缺損處于周圍正常組織界限不清晰。空白對照組切片的甲苯胺藍染色結果為陰性。

3 討論

如何找到合適的載體為修復的主要任務。理想的載體應該具備以下幾個優點：（1）與宿主細胞有良好相容性；（2）有理想三維結構；（3）具有良好可塑性，可以將其制備成所需形狀；（4）有生物降解性質[5-7]。傳統的載體選擇一般都為商品化的人纖維蛋白膠，但是在美國因為考慮疾病的傳播而被限制使用。硫酸銨沉淀法是比較簡便的一種制備纖維蛋白原的方法，并且可以避免疾病傳播。在本次的使用中發現其具有較理想的實用性。

在本次的研究中，來自本身的軟骨細胞和生物蛋白膠復合，對于軟骨損傷的修復有理想的效果，明顯優于對照組。但是在蘇木精-伊紅和甲苯胺藍的顏色中顯示，以纖維軟骨為主的修復，所以不能完全替代原來透明軟骨的功能。在甲苯胺藍染色結果中，缺損的細胞還具有相關活性。有數據報道，自體軟骨細胞在移植過程中細胞可以不用擴散而達到和體外擴增相當的修復效果[8]。

近年來也有報道使用自體軟骨細胞修復關節缺損并取得良好效果的報道[9-10]。從本次試驗結果來看，運用自體軟骨組織病理病理切片等均顯示修復效果良好。因此筆者認為，軟骨細胞復合纖維蛋白可以很好地修復關節軟骨的缺損，可以考慮用于再生修復軟骨的缺損。

參考文獻

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（收稿日期：2015-06-30） （本文編輯：王宇）