真菌（1—3）—β—D葡聚糖體外檢測影響因素探討

向成玉 丁銀環(huán) 景翠源

【摘要】 目的：探討念珠菌細胞壁成分（1-3）-β-D葡聚糖檢測的體外影響因素;方法：實驗組：將白色假絲酵母菌用正常血漿、無熱原蒸餾水、0.9%的生理鹽水、0.02%兩性霉素B生理鹽水和0.75%氟康唑生理鹽水稀釋為0.5麥氏單位（含白色念珠菌1X10⁷CFU/ml），對照組：將上述各液稀釋100倍，采用免疫沉淀試驗（G試驗）檢測其10次（1-3）-β-D葡聚糖含量，并進行體外培養(yǎng)，以此探討生理鹽水、抗真菌藥物對（1-3）-β-D葡聚糖體外檢測的影響;結果：實驗組中，正常血漿葡聚糖含量為（92.5土14.2） ug/l，蒸餾水組含量為（94.5土15.2） ug/l，生理鹽水組含量為為（93.6土14.8） ug/l，兩性霉素B組含量為（95.5土16.2） ug/l，氟康唑組（97.3土16.8） ug/l，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)結果間無顯著性差異（P>0.05）。對照組中：正常血漿含量為（6.8土2.7） ug/l，蒸餾水組含量為（6.1土2.4） ug/l，生理鹽水組含量為為（7.3土2.0） ug/l，兩性霉素B含量為（6.8土2.5） ug/l，氟康唑組（6.7土2.8）ug/l，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)間結果無顯著性差異（P>0.05）。實驗組與對照組比較有顯著差異（p<0.001）。結論：體外真菌細胞壁（1-3）-β-D葡聚糖含量變化與液體介質(zhì)的無關，與真菌治療藥物無關，與念珠菌數(shù)量密切相關。

關鍵詞?? （1-3）-β-D葡聚糖? 體外檢測? 兩性霉素B 氟康唑

[Abstract]? ObjectiveTo study the influence factors of the detection of fungal cell wall 1，3-β-D-glucan in virto.Methods The experimental group：? the Candida albicans were diluted with normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline as 0.05 McIntosh unit （containing candida albicans 1X107CFU/ml）. The control group： diluting the precursory solutions to 100 times. Measuring the concentration of 1，3-β-D-glucan in the solutions 10 times through G test ， and culturing the Candida albicans in each solution in virto to study the influence of antifungal drugs， physiological saline on the testing of 1，3-β-D-glucan in vitro.Results The experimental group： the concentration of 1，3-β-D-glucan in normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline were （92.5土14.2） ug/l，（94.5土15.2） ug/l， （93.6土14.8） ug/l，（95.5土16.2） ug/l， and （97.3土16.8） ug/l. The differences in the group are not significant by statistics test （P > 0.05）. The control group： the concentration of 1，3-β-D-glucan in normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline were （92.5土14.2） ug/l，（94.5土15.2） ug/l，（93.6土14.8） ug/l，（95.5土16.2） ug/l， and （97.3土16.8） ug/l. The differences in the group are not significant by statistics test （P > 0.05）. There were significant differences between the experimental group and the control group （P < 0.001）.Conclusion? The concentration of Fungal 1，3-β-D-glucan in virto has noting to do with liquid mediums or antifungal drugs， but is closely related to the number of candida.

Key words：? 1，3-β-D-glucan; detection in virto;? amphotericin B; fluconazole

真菌（1-3）-β-D葡聚糖的檢測是診斷深部真菌感染的快速準確的方法，其特異性和敏感性已經(jīng)得到一致的公認^[1.2]。但是據(jù)報道生物大分子和頭孢菌素等對檢測結果有影響^[1.2]，常常出現(xiàn)假陽性假陰性結果。為了觀察體外檢測過程中是否受到介質(zhì)的影響。我們選擇了正常血漿、無熱原蒸餾水、0.9%的生理鹽水、0.02%兩性霉素B生理鹽水和0.75%氟康唑生理鹽水對白色念珠菌進行稀釋，以觀察治療用藥兩性霉素B和氟康唑?qū)w外檢測結果的影響。

1材料與方法

儀器與試劑：MD-80型微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)，T01智能恒溫儀，冰浴槽以及GKT109動態(tài)真菌檢測試劑盒（定量），均由北京金山川科技發(fā)展公司提供。

待測液制備：將白色假絲酵母菌用正常血漿、無熱原蒸餾水、0.9%的生理鹽水、0.02%兩性霉素B生理鹽水和0.75%氟康唑生理鹽水稀釋為0.5麥氏單位（含白色念珠菌1X10⁷CFU/ml）。取上述制備好的各樣本100ul，加入樣品處理液中混勻后70℃保溫10分鐘取出后立刻放入冰水浴中即為待測樣品。細菌培養(yǎng)取每種液體10ul也傾注平板接種，根據(jù)生長的菌落進行計算。

測定分析：取待測樣品200ul直接加入反應主劑中，溶解后使用微量加樣器轉移至10X75mm標準玻璃反應管中，不要產(chǎn)生氣泡。插入MD-80微生物快速動態(tài)測定系統(tǒng)中進行反應，反應結束后由標準曲線自動計算出待測血漿中葡聚糖含量。操作過程中注意避免微生物及細菌污染。

統(tǒng)計分析：測定結果用spss17.0統(tǒng)計軟件t檢驗進行分析，（1-3）-β-D葡聚糖含量以均數(shù)± 標準差表示，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結果

2.1、兩組（1-3）-β-D葡聚糖檢測結果

實驗組中，正常血漿葡聚糖含量為（92.5土14.2） ug/l，蒸餾水組含量為（94.5土15.2） ug/l，生理鹽水組含量為為（93.6土14.8） ug/l，兩性霉素B組含量為（95.5土16.2） ug/l，氟康唑組（97.3土16.8） ug/l，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)結果間無顯著性差異（P>0.05）。對照組中：正常血漿含量為（6.8土2.7） ug/l，蒸餾水組含量為（6.1土2.4） ug/l，生理鹽水組含量為為（7.3土2.0） ug/l，兩性霉素B含量為（6.8土2.5） ug/l，氟康唑組（6.7土2.8）ug/l，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)間結果無顯著性差異（P>0.05）。實驗組與對照組比較有顯著差異（p<0.001）.（見表1）

2.2、兩組白色念珠菌菌落數(shù)檢測結果

實驗組中，正常血漿組含量為100萬個CFU/L，蒸餾水組含量為100萬個CFU/L，生理鹽水組含量為為100萬個CFU/L，兩性霉素B組含量為0個CFU/L，氟康唑組0個CFU/L，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)結果間無顯著性差異（P>0.05）。對照組中：正常血漿組含量為2000個CFU/L，蒸餾水組含量為2000個CFU/L，生理鹽水組含量為為2000個CFU/L，兩性霉素B含量為0個CFU/L，氟康唑組0個CFU/L，經(jīng)統(tǒng)計檢驗組內(nèi)間結果無顯著性差異（P>0.05）。實驗組與對照組比較有顯著差異（p<0.001）。（見表2）

表1??? 兩組（1-3）-β-D葡聚糖濃度（pg/l）

組??? 別????? 實驗組β-D（X土S）????? 對照組β-D（X土S）

血??? 漿????? 92.5土14.2※▲?????????? 6.8土2.7

蒸 餾 水????? 94.5土15.2※▲?????????? 6.1土2.4

生理鹽水????? 93.6土14.8※▲?????????? 7.3土2.0

兩性霉素????? 95.5土16.2※▲?????????? 6.8土2.5

氟 康 唑?? ??97.3土16.8※▲?????????? 6.7土2.8

※組內(nèi)比較結果無顯著差異（p>0.05），▲組間比較結果有顯著差異（P<0.05）

表2 兩組白色念珠菌菌落數(shù)（CFU/L）

組? 別????????????? 實驗組（萬個CFU/L）??????? 對照組（個CFU/L）

血漿組??????????????????? 100????????????????? 1900

蒸餾水??????????????????? 100????????????????? 1800

生理鹽水??? ??????????????100????????????????? 2000

兩性霉素????????????????? 0??????????????????? 0

氟康唑??????????????????? 0??????????????????? 0

※組內(nèi)比較結果無顯著差異（p>0.05），▲組間比較結果有顯著差異（P<0.05）

3討論

（1-3）-β-D葡聚糖是一種多糖，普遍存在于除接合菌外的真菌細胞壁中，占真菌細胞壁干重的50%以上，尤其在酵母樣真菌中含量最高，其他微生物如細菌、病毒及動物、人體細胞均缺乏此成分。（1-3）-β-D葡聚糖由D.葡萄糖聚合而成，以β（1-3）糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈，分支狀β（1-6）糖苷鍵連接的葡萄糖殘基作為側鏈^[3]， 血漿（1-3）-β-D葡聚糖檢測常用免疫沉淀試驗（G試驗）方法。

某些情況可干擾檢測結果而出現(xiàn)假陽性及假陰性，本研究中所需器皿均行滅菌、去熱源處理，操作中堅持無菌原則，所選溶解介質(zhì)均排除了干擾因素，檢測結果可靠。

結果發(fā)現(xiàn)，實驗組內(nèi)與對照組組內(nèi)葡聚糖體外檢測結果無顯著差異，表明葡聚糖體外檢測結果與檢驗時的液體介質(zhì)無關。組間結果差異有顯著性，表明與念珠菌菌落數(shù)顯著相關。在本研究中，白色念珠菌菌落數(shù)小于10000 CFU/L，其（1-3）-β-D葡聚糖濃度體外檢測結果低于參考值7.5 pg/ml。可能的原因是本實驗時念珠菌細胞壁成分釋放不充分，而且在體外環(huán)境和動物環(huán)境中釋放方式的不確定性，尚需在動物模型的感染方面進行試驗。

參考文獻

[1]. 李岷，吳紹熙，一種深部真菌早期診斷的新方法-測定真菌細胞壁成分葡聚糖。國外醫(yī)學皮膚性病學分冊。1998，24（6）：344-346。

[2]. 張建芳，徐修禮，樊新等 ，深部真菌感染患者血漿葡聚糖檢測的臨床意義。中華醫(yī)院感染學雜志，2005.15（3）：354-355。[3]呂沛華，趙蓓蕾， 施毅等. （1-3）-β-D葡聚糖檢測診斷侵襲性真菌感染的臨床價值.中華結核和呼吸雜志.2007 ，30（1）：31-34.