Ghrelin預處理對H9C2心肌細胞缺氧／復氧損傷的影響

陳瑩瑩，吳繼雄，王 靚，何 非

Ghrelin預處理對H9C2心肌細胞缺氧／復氧損傷的影響

陳瑩瑩1，吳繼雄1，王 靚2，何 非1

目的探討Ghrelin預處理對H9C2心肌細胞缺氧／復氧損傷的影響。方法培養H9C2心肌細胞并建立心肌細胞缺氧（21 h）／復氧（6 h）模型。細胞隨機分成4組：對照組，缺氧／復氧組（H／R組），缺氧／復氧＋Ghrelin組（H／R＋G組），缺氧／復氧＋Ghrelin＋生長激素促分泌素受體（GHSR）-siRNA組（H／R＋G＋G-siRNA組）；采用siRNA干擾技術阻斷Ghrelin受體GHSR的表達以及Hoechst 33258染色劑和流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，Western blot法檢測各組凋亡相關蛋白表達情況。結果GHSR存在于正常H9C2心肌細胞中，GHSR-siRNA可以顯著抑制H9C2心肌細胞中GHSR的表達。與H／R組相比，在H／R＋G組中缺氧／復氧損傷所導致心肌細胞的凋亡率明顯下降（P＜0.05），B淋巴細胞瘤-2蛋白／Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2／Bax）比率明顯上調（P＜0.05），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）表達水平被顯著抑制（P＜0.05）。而與H／R＋G組相比，H／R＋G＋G-siRNA組心肌細胞凋亡率增加（P＜0.05），Bcl-2／Bax比率顯著下降（P＜0.05），caspase-3表達上調（P＜0.05）。結論Ghrelin具有減輕缺氧／復氧所引起的心肌細胞損傷、抑制心肌細胞凋亡的作用。

H9C2細胞株；缺氧／復氧損傷；Ghrelin；凋亡

臨床上應用的溶栓、經皮冠狀動脈介入治療以及冠狀動脈搭橋手術能夠有效治療心肌梗死，再血管化治療后引起的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）嚴重影響患者的預后［1］，因此如何降低MIRI現已成為心臟病學研究的重點和熱點問題。心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要病理改變，長期的心肌細胞凋亡可以導致臨床早期心肌舒張功能降低，晚期合并心肌收縮功能障礙及心臟衰竭的形成。因此，減少再灌注期心肌細胞的損傷是減輕MIRI的有效途徑。Ghrelin是1999年首次從胃組織中發現，由28個氨基酸組成的腦腸肽，是生長激素促分泌素受體（growth secretagogue receptor，GHSR）的內源性配體［2］。GHSR屬于G蛋白偶聯受體家族，以兩種亞型的形式存在，即GHS-R1a和GHS-R1b。Ghrelin及其受體GHSR存在于許多器官和組織中，Ghrelin通過與GHSR結合參與了食欲、能量、體重的調節，糖和脂肪的代謝，胃腸、心血管和免疫功能的調節以及細胞的增殖和凋亡等諸多生理作用，并且可以通過siRNA干擾阻斷GHSR的表達，從而影響Ghrelin各項生理作用的發揮［3－4］。Ghrelin及其受體在人的心臟和血管中都有表達［5］。在心血管系統中，Ghrelin可以增加心肌收縮力，改善由心肌梗死引起的心臟衰竭，并且這種心臟保護作用的發揮不依賴于生長激素的釋放［6］。該研究利用H9C2心肌細胞株建立心肌細胞缺氧／復氧模型，模擬心肌細胞的缺血再灌注，同時運用siRNA技術阻斷GHSR的表達，觀察各實驗組心肌細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白的表達情況，研究Ghrelin預處理對缺氧復氧心肌細胞的保護作用以及對心肌細胞凋亡的抑制作用，為減少心肌細胞缺血再灌注損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2心肌細胞株（中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心）；Ghrelin（美國Phoenixbiotech公司）；胰蛋白酶（中國Biosharp公司）；DMEM高糖培養基（美國Hyclone公司）；DMEM低糖培養基、Opti-MEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物技術有限公司）；Hoechst33258染色試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；GHSR、B淋巴細胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）抗體（美國Cell Signaling Technologies）；β-actin、過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天公司）；PVDF膜（美國密理博公司）；GHSR-siRNA和scramble siRNA（雜亂siRNA，即陰性對照組）（廣州銳博生物科技有限公司）。GHSR-siRNA序列如下，上游引物：5’-CGTCACGTTGGACCTGGATTTCAAGAGAATC CAGGTCCAACGTGACGTTTTTT-3’，下游引物：5’-AATTAAAAAACGTCACGTTGGACCTGGATTCTCTTGA AATCCAGGTCCAACGTGACGGGCC-3’。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2心肌細胞的培養 細胞培養基成分是DMEM、10%胎牛血清、100 U／ml青霉素和100 mg／ml鏈霉素，置37℃、95%的空氣和5%CO2培養箱中培養，培養48 h換液，以后每2 d換液1次，細胞覆蓋率達80%后用于建立模型。

1.2.2 建立心肌細胞缺氧／復氧模型 利用0.5%胎牛血清、低糖DMEM培養基在缺氧培養箱（95% N2，5%CO2）、37℃下處理21 h，然后更換0.5%胎牛血清的DMEM培養基在常規37℃、5%CO2培養箱中進行復氧處理6 h［7］。對照組一直在10%胎牛血清的DMEM培養基在常規37℃、5%CO2培養箱下培養。

1.2.3 Ghrelin預處理 使用6孔板接種H9C2心肌細胞，將其在DMEM完全培養液（含10%胎牛血清）中培養至70%～80%匯合，然后以無血清培養液饑餓培養24 h。更換已加入了1×10－6mol／L的Ghrelin的DMEM完全培養基培養1 h［8］。Ghrelin預處理后，用PBS洗滌3遍，更換不含Ghrelin的低糖DMEM培養基（含0.5%胎牛血清）進行心肌細胞缺氧／復氧處理。

1.2.4 實驗分組 將培養的細胞隨機分成4組（n＝8）：對照組、缺氧／復氧組（H／R組）、缺氧／復氧＋Ghrelin預處理組（H／R＋G組）、缺氧／復氧＋Ghrelin＋GHSR-siRNA組（H／R＋G＋G-siRNA組，Ghrelin預處理前予以siRNA干擾GHSR表達）。

1.2.5 利用siRNA干擾H9C2心肌細胞中GHSR的表達 siRNA干擾技術被用于沉默H9C2心肌細胞中GHSR的表達，細胞被接種于6孔板中，用無雙抗的完全培養基培養24 h以后，按照說明書利用Lipofectamine 2000將GHSR-siRNA或scramble siRNA轉染入細胞，細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。siRNA的干涉效率由Western blot檢測，將細胞隨機分成3組（n＝8）：空白對照組、scramble siRNA組（陰性對照組）、GHSR-siRNA組。

1.2.6 Hoechst33258染色 根據Hoechst33258染色試劑盒所提供的方法檢測各處理組中心肌細胞凋亡情況，熒光顯微鏡下以紫外光激發，發出藍色熒光。觀察細胞核，固縮、濃集、變亮的細胞核認為是凋亡細胞核。每組5張不同的玻片上隨機選取5個高倍視野，觀察凋亡情況。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 根據Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒所提供的方法檢測Ghre1in對缺氧／復氧損傷的H9C2細胞凋亡的調節作用。將處理后的細胞收集上清液中懸浮的細胞，貼壁的細胞用不含EDTA的胰酶消化后，收集細胞，2 000 r／min離心5 min，棄培養基。用冷PBS洗滌細胞2次。用400μl 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106個／ml。在細胞懸浮液中加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育5min。加入10μl PI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.8 Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達情況 總蛋白樣本提?。号囵B的心肌細胞，每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min后于4℃下13 000 r／min離心5 min。將離心后的上清液分裝收集放于－20℃保存。采用BCA法測定蛋白含量并制作標準曲線。采用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配置10%分離膠，每個泳道蛋白上樣量為20 μg，樣本在分離膠中泳動時，電壓為80 V，條帶進入分離膠，電壓增至100 V。轉膜2 000 mA恒流轉移80 min；轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉2 h，之后孵一抗4℃過夜。用TBST漂洗后將膜放入稀釋后的二抗中，37℃孵育2 h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統分析結果。

1.3 統計學處理采用SPSS 10.0統計軟件進行分析。實驗結果以±s表示，各組間進行方差分析，如方差不齊則進行非參數分析（Kruskal-Wallis H檢驗），并進行q檢驗。

2 結果

2.1 GHSR在H9C2心肌細胞中的表達Western blot結果表明，GHSR存在于正常H9C2心肌細胞中，GHSR-siRNA可以顯著抑制H9C2心肌細胞中GHSR的表達，而在空白對照組和scrambled siRNA組（陰性對照組）中未見明顯的抑制作用。見圖1。

2.2 Ghrelin預處理對H9C2心肌細胞凋亡的影響

由Hoechst33258染色可見，對照組細胞核呈彌散均勻暗淡的藍色熒光；而H／R組可見典型的凋亡細胞核表現，即細胞核固縮、變亮、變圓、呈藍白色熒光，呈現明顯的凋亡特征；而H／R＋G組凋亡細胞明顯減少，H／R＋G＋G-siRNA組凋亡細胞較H／R＋G組增多，見圖2。Annexin V-FITC／PI檢測顯示，H／R組心肌細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），H／R＋G組心肌細胞凋亡率顯著低于H／R組（P＜0.05），而H／R＋G＋G-siRNA組凋亡率明顯高于H／R＋G組（P＜0.05）。見圖3、表1。

2.3 Ghrelin預處理對于H9C2心肌細胞缺氧／復氧損傷后Bcl-2和Bax以及cleavedcaspase-3蛋白表達的影響H／R組相對于對照組Bcl-2蛋白表達水平顯著下降，而Bax蛋白水平顯著升高，所以Bcl-2／Bax顯著降低（P＜0.05）；而予以Ghrelin預處理后，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，同時Bax蛋白表達量顯著下降，Bcl-2／Bax也相應上升（P＜0.05）。與G＋H／R組相比，用siRNA抑制GHSR表達可以使得H／R后H9C2心肌細胞Bcl-2蛋白表達水平下降而Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2／Bax相應降低（P＜0.05）。同樣，在H／R組中caspase-3蛋白表達水平相對于對照組顯著升高（P＜0.05），而這種升高在H／R＋G組中被顯著抑制（P＜0.05），然而在H／R＋G＋G-siRNA組中caspase-3蛋白表達量升高（P＜0.05）。見圖4、表1。

3 討論

本研究探討了Ghrelin對缺氧／復氧干預下的心肌細胞凋亡的阻斷作用。結果顯示Ghrelin的受體GHSR存在于正常H9C2心肌細胞中，用siRNA-GHSR沉默后可以顯著抑制H9C2心肌細胞中GHSR的表達。予以Ghrelin預處理可以顯著減輕再灌注后心肌細胞的凋亡率，以及抑制復氧期促凋亡蛋白Bax的表達和caspase-3的激活，以及上調抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，繼而減少心肌細胞凋亡，具有心肌細胞保護作用。而予以GHSR-siRNA沉默GHSR的表達之后Ghrelin的這種心肌細胞的保護作用被抑制。

表1 各組實驗數據的統計檢驗結果（n＝8，±s）

表1 各組實驗數據的統計檢驗結果（n＝8，±s）

項目對照組H／R組H／R＋G組H／R＋G＋G-SiRNA組χ2值P值凋亡率（%）（平均秩次）4.25±1.54（5.50）46.42±5.52（35.50）11.35±2.88（15.50）22.14±3.66（25.50）36.589 0.000 Bcl-2／Bax（平均秩次）1.00±0.02（35.50）0.11±0.01（5.50）0.78±0.06（25.50）0.28±0.02（15.50）36.890 0.000 caspase-3（平均秩次）1.00±0.03（5.50）6.15±0.50（34.65）2.82±0.28（15.50）5.30±0.44（26.35）35.524 0.000

Ghrelin是GHSR的天然內源性配體，同時也最先被認為是生長激素釋放的強有力的刺激因素［2］。本研究證實GHSR存在于正常H9C2心肌細胞中，表明Ghrelin可能通過心肌細胞的GHSR發揮著心血管調節作用，這與此前的研究［9］結果一致。此外，研究［10］表明Ghrelin可以提高慢性心力衰竭大鼠的心輸出量、左室射血分數和左室最大壓力變化率，以及抑制左室肥大。更有研究發現，Ghrelin也可以在成年大鼠中抑制有氧化應激刺激引起的心肌細胞凋亡［11］。

凋亡是一種復雜的有秩序的細胞自主生化過程，是引起心肌缺血再灌注損傷的主要機制和病例特征之一［12］。細胞凋亡的發生受到細胞內凋亡調節蛋白的調節，這些凋亡調節蛋白分為促凋亡蛋白（如Bax，Bak）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2，Bcl-xL）兩大類。在一系列的刺激或者損傷后促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡決定著細胞是生存還是出現凋亡的關鍵［13］。所以常以Bax／Bcl-2的比率來反映細胞的凋亡水平［14］。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執行者，其中caspase-3是caspases級聯“瀑布”下游最關鍵的凋亡蛋白酶，caspase-3也是細胞凋亡的重要標志物之一［15］。

本研究中，H／R組的H9C2細胞可見大量細胞核濃縮，呈亮藍白色的凋亡細胞，流式細胞術證實凋亡率約為（46.42±5.52）%，較對照組和單純缺氧組明顯上升，表明缺氧／復氧損傷模型可以有效地模擬體外缺血再灌注損傷。隨即探討Ghrelin是否具有減輕H9C2細胞缺氧／復氧損傷的作用。Ghrelin預處理后，凋亡細胞顯著減少，用GHSR-siRNA沉默Ghrelin受體的表達后，凋亡細胞較H／R＋G組顯著增加，流式細胞術進一步證實相較于H／R組，Ghrelin預處理將心肌細胞缺氧／復氧損傷所導致的凋亡率從（46.42±5.52）%降低至（11.35±2.88）%，GHSR-siRNA沉默GHSR的表達后，凋亡率又上升至（22.14±3.66）%。Western blot結果表明，Ghre-lin預處理后抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著升高、促凋亡蛋白Bax表達量降低。Bcl-2／Bax比例的降低可以促進凋亡蛋白caspase-3從線粒體釋放，從而啟動細胞凋亡程序，所以還可以觀察到Ghrelin預處理可以引起caspase-3蛋白表達量顯著減少。此外，GHSR-siRNA沉默細胞中GHSR的表達，Bcl-2／Bax蛋白表達量比率顯著減少，而caspase-3蛋白表達量增加。以上實驗結果均表明Ghrelin預處理在培養心肌細胞缺氧／復氧損傷中具有顯著抗凋亡效應，而予以GHSR敲除之后Ghrelin的這種抗凋亡作用消失，進一步驗證了Ghrelin通過與受體GHSR結合而發揮心血管保護作用。由于早期的抗凋亡處理可以減少缺血后持續的再灌注所引起的心肌梗死的面積。因此可以得出結論Ghrelin通過減少心肌缺血再灌注損傷引起的凋亡而起到心臟保護作用。

［1］ Cokkinos D V，Pantos C.Myocardial protection in man-from research concept to clinical practice［J］.Heart Fail Rev，2007，12（3－4）：345－62.

［2］ Kamegai J，Tamura H，Shimizu T，et al.The role of pituitary ghrelin in growth hormone（GH）secretion：GH－releasing hormonedependent regulation of pituitary ghrelin gene expression and peptide content［J］.Endocrinology，2004，145（8）：3731－8.

［3］ Sato T，Nakamura Y，Shiimura Y，et al.Structure，regulation and function of ghrelin［J］.JBiochem.2012，151（2）：119－28.

［4］ LiB，Zeng M，HeW，et al.Ghrelin protects alveolarmacrophages against lipopolysaccharide-induced apoptosis through growth hormone secretagogue receptor 1a-dependent c-Jun N-terminal kinase and Wnt／β-Catenin signaling and suppresses lung inflammation［J］.Endocrinology，2015，1（1）：203－17

［5］ Kleinz M J，Maguire JJ，Skepper JN，et al.Functional and immunocytochemical evidence for a role of ghrelin and des-octanoyl ghrelin in the regulation of vascular tone in man［J］.Cardiovasc Res，2006，69（1）：227－35.

［6］ Nagaya N，Uematsu M，Kojima M，et al.Elevated circulating level of ghrelin in cachexia associated with chronic heart failure：relationships between ghrelin and anabolic／catabolic factors［J］.Circulation，2001，104（17）：2034－8.

［7］ Park M，Youn B，Zheng X L，et al.Globular adiponectin，acting via AdipoR1／APPL1，protects H9c2 cells from hypoxia／reoxygenation-induced apoptosis［J］.PLoSOne，2011，6（4）：e19143.

［8］ Baldanzi G，Filigheddu N，Cutrupi S，et al.Ghrelin and des-acyl ghrelin inhibit cell death in cardiomyocytes and endothelial cells through ERK1／2 and PI3-kinase／AKT［J］.JCell Biol，2002，159（6）：1029－37.

［9］ Papotti M，GhèC，Cassoni P，et al.Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues［J］.J Clin Endocrinol Metab，2000，85（10）：3803－7.

［10］Nagaya N，Uematsu M，Kojima M，et al.Chronic administration of ghrelin improves left ventricular dysfunction and attenuates development of cardiac cachexia in rats with heart failure［J］.Circulation，2001，104（12）：1430－5.

［11］Kui L，Weiwei Z，Ling L，etal.Ghrelin inhibits apoptosis induced by high glucose and sodium palmitate in adult rat cardiomyocytes through the PI3K-Akt signaling pathway［J］.Regul Pept，2009，155（1－3）：62－9.

［12］Jin Y C，Kim CW，Kim Y M，et al.Cryptotanshinone，a lipophilic compound of Salvia miltiorrriza root，inhibits TNF-alpha-induced expression ofadhesionmolecules in HUVEC and attenuates ratmyocardial ischemia／reperfusion injury in vivo［J］.Eur JPharmacol，2009，614（1－3）：91－7.

［13］Liao Y H，Xia N，Zhou S F，et al.Interleukin-17A contributes to myocardial ischemia／reperfusion injury by regulating cardiomyocyte apoptosis and neutrophil infiltration［J］.JAm Coll Cardiol，2012，59（4）：420－9.

［14］Babu PP，Suzuki G，Ono Y，et al.Attenuation of ischemia and／orreperfusion injury during myocardial infarction using mild hypothermia in rats：an immunohistochemical study of Bcl-2，Bax，Bak and TUNEL［J］.Pathol Int，2004，54（12）：896－903.

［15］LiQ，LiZ，Xu X Y，etal.Neuroprotectivepropertiesof picroside II in a ratmodel of focal cerebral ischemia［J］.Int JMol Sci，2010，11（11）：4580－90.

Effect of pretreatment w ith Ghrelin on hypoxia／reoxygenation injury in H9C2 cells

Chen Yingying1，Wu Jixiong1，Wang liang2，et al
（1Dept of Cardiology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Pharmacology，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230032）

Objective To determine the effectof pretreatmentwith Ghrelin on hypoxia／reoxygenation（H／R）injury in rat cardiomyocytes.MethodsCultured H9C2 cells were random ly divided into 4 groups，including control group，H／Rgroup，H／R＋Ghrelin group，and H／R＋Ghrelin＋growth secretagogue receptor（GHSR）-siRNAgroup.H／R injury was established by 21 hours of hypoxia and subsequent 6 hours of reoxygenation.Expression of growth GHSR in H9C2 cellswas reduced by siRNA.Apoptosis of H9C2 cardiomyocytes under different treatments following H／R injury was observed by Hoechst 33258 staining and apoptotic rate was detected by flow-cytometry analysis.Besides，Western blot analysiswas performed to detect the expression of the apoptosis related proteins in each group.ResultsGHSR was expressed in H9C2 cells and the expression of GHSR could be significantly knocked down by GHSR-siRNA.Compared with H／R group，in H／R＋Ghrelin group the myocardium apoptotic rate wasmarkedly decreased（P＜0.05），the Bcl-2／Bax ratio was increased（P＜0.05）and the expression of caspase-3 protein was decreased（P＜0.05）.However，compared with H／R＋Ghrelin group，the apoptotic rate was increased（P＜0.05），the Bcl-2／Bax ratio was decreased（P＜0.05）and the expression of caspase-3 protein was up-regulated（P＜0.05）in H／R＋Ghrelin＋GHSR-siRNA group.ConclusionGhrelin provides concrete protection against H／R injury by inhibiting apoptosis in cardiomyocytes.

H9C2 cells；hypoxia／reoxygenation injury；Ghrelin；apoptosis

R 322.11；R 845.22

A

1000－1492（2015）08－1058－06

2015－03－27接收

國家自然科學基金（編號：81202631）

1安徽醫科大學第二附屬醫院心血管內科，合肥 230601

2安徽中醫藥大學藥理學教研室，合肥 230032

陳瑩瑩，女，碩士研究生；

吳繼雄，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wjx8261＠163.com