小鼠骨髓源性樹突狀細胞體外誘導培養體系的構建

劉振明，胡何節，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

◇技術與方法◇

小鼠骨髓源性樹突狀細胞體外誘導培養體系的構建

劉振明，胡何節，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

建立一種體外誘導培養小鼠骨髓源性的樹突狀細胞（DCs）方法，在鏡下可觀察到培養出的未成熟樹突狀細胞（imDCs）比成熟樹突狀細胞（mDCs）細胞突起少。流式細胞術檢測CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在imDCs的表達顯著低于在mDCs上的表達。同種異基因混合淋巴細胞反應顯示DCs刺激T細胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強，在相同比例條件下對刺激T細胞增殖的能力，imDCs顯著低于成熟mDCs。該誘導方法可獲得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性DCs。

小鼠；樹突狀細胞；細胞培養

目前的研究［1］認為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發生、發展到轉歸是一種慢性炎癥反應的病理過程，有大量的免疫細胞和炎癥介質參與其中。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）作為目前已知的體內功能最強的專職抗原提呈細胞（antigen－presenting cell，APC），也是唯一能在體內直接激活初始T細胞的抗原提呈細胞，其在誘導T淋巴細胞活化，刺激初始T淋巴細胞增殖、介導免疫耐受等方面發揮著重要作用［2］。該研究通過提取小鼠骨髓細胞體外培養DCs，旨在為后續其在AS小鼠模型上進行其免疫功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠，6～8周齡，約20 g，清潔級，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 南美胎牛血清（fetal calf serum，FCS）購自美國Hyclone公司；RPMI 1640全培養液購自美國Gibco公司；重組小鼠粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子（recombinantmurine granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）及重組小鼠白介素-4（recombinant murine interleukin-4，rm IL-4）購自美國Peprotech公司；脂多糖（lipopdysaccharide，LPS）及甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Sigma公司；小鼠流式單克隆抗體FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86、PEMHC-Ⅱ及其同型對照抗體購自美國eBioscience公司。

1.1.3 主要儀器 流式細胞儀購自美國BD公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Thermo恒溫培養箱購自美國Thermo公司；酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓源性DCs的分離、培養及誘導將C57BL／6小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側股骨、脛骨，仔細剝離附著的肌肉組織，用PBS反復洗滌，無菌剪刀剪去骨干兩端，1 ml注射器抽取RPMI 1640全培養液反復沖洗骨髓腔直至變白，沖洗液經400目濾網過濾去除組織碎片，收集細胞懸液至15 m l離心管中，以1 200 r／min離心5 min，去除上清液，用含12%FCS的RPMI 1640全培養液配成細胞懸液，細胞計數板計數，調整細胞濃度為5 ×105／ml，加入rmGM-CSF（終濃度20 ng／m l）及rm IL-4（終濃度20 ng／ml），分裝于培養瓶，置入37℃、5%CO2培養箱中培養。48 h后收集懸浮細胞，1 200 r／min離心5 min，去除上清液，補充含12% FCS的RPMI 1640全培養液及rmGM-CSF、rm IL-4細胞因子，以后隔日半量換液，第5天將收集的懸浮細胞分成兩組，一組在培養液中加入LPS（1μg／ml）刺激成熟，培養至第7天收集懸浮細胞，流式細胞術檢測其表面共刺激分子的表達，另一組不做LPS刺激處理，培養至第7天收集懸浮細胞，流式細胞術檢測其表面共刺激分子的表達。

1.2.2 細胞形態學觀察 倒置顯微鏡下動態觀察DCs的形態及數量的變化并攝影記錄。

1.2.3 流式細胞術檢測DCs表面分子 分別收集兩組細胞離心后去上清液，將約4×105個DCs懸于300μl PBS，按照流式抗體說明書進行抗體標記及同型對照標記，4℃避光孵育30 min，加1 m l PBS洗滌離心，重懸于300μl PBS中，流式檢測兩組細胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達情況。

1.2.4 MTT法檢測同種異基因混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR） 頸椎脫臼法處死BALB／c小鼠，無菌條件下取出其脾臟，剪碎研磨經400目濾網過濾，得到細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離出單核細胞，尼龍毛柱法獲得同種異體T細胞作為反應細胞，調整密度為2×106／ml。取上述方法獲得的C57BL／6小鼠骨髓性未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells，imDCs）和成熟樹突狀細胞（mature dendritic cells，mDCs），加入終濃度為25μg／ml的絲裂霉素C，37℃孵育45 min，PBS洗滌2遍，按照DC∶T細胞比例為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的反應比鋪于96孔板中，每個比例設置3個復孔，設單純的DC細胞和單純T細胞為陰性對照組，設培養液為空白對照組，在37℃、5% CO2條件下共培養72 h，共培養結束前4 h，在每孔中加入20μl MTT繼續培養4 h，每孔吸取培養液后加入150μl的DMSO，室溫震蕩10min，酶標儀測定各孔的吸光度（absorbance，A）值，檢測波長為570 nm。刺激指數（stimulation index，SI）＝（待測樣品孔A值－培養液對照組A值）／（陰性對照組A值－培養液對照組A值）。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，數據以±s表示。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下動態觀察DCs的形態及數量的變化倒置顯微鏡下可見細胞在開始的48 h內呈貼壁生長，細胞體積較小，有少量的細胞聚集現象。培養48 h后，部分細胞開始出現半懸浮狀態，并形成細胞集落，少量細胞表面出現毛刺狀突起。培養的第5天鏡下觀察可見大量細胞集落，細胞集落表面可見大量長短不一的突起，細胞體積進一步增大，呈懸浮狀態。加入LPS刺激48 h后，可見大量毛刺狀突起的DCs從集落釋放出來，呈游離狀態，而未加LPS刺激的DCs仍呈集落聚集生長。見圖1。

2.2 流式檢測DCs表面分子細胞培養第7天分別收集兩組細胞，用流式細胞術分析其表面分子的表達情況。結果顯示，兩組細胞均高表達CD11c分子，純度＞90%。未加LPS刺激組的DCs低表達CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子，細胞表現為未成熟狀態，而在LPS刺激組這些表面分子則呈現出明顯的高表達，細胞表現為成熟狀態。見圖2。

2.3 M TT法測兩組DCs對同種異基因T細胞的刺激增殖能力單因素析因方差分析結果顯示兩組DCs刺激T細胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強，在相同比例條件下，imDCs刺激T細胞增殖的能力顯著低于mDCs刺激T細胞增殖的能力，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 M LR中im DCs和mDCs對T細胞的SI

表1 M LR中im DCs和mDCs對T細胞的SI

組別n DC∶T細胞比例1∶5 1∶10 1∶20 1∶40 F值P值imDCs 3 1.38±0.04 1.29±0.02 1.16±0.04 1.04±0.06 39.243 0.000 mDCs 3 2.35±0.07 1.95±0.05 1.43±0.02 1.31±0.11 149.699 0.000 F值504.0 410.2 129.3 14.8 P值0.000 0.000 0.000 0.020

3 討論

本實驗采用Lutz et al［3］創建的小鼠骨髓性DCs培養方法，利用細胞的懸浮性能去除貼壁的單核細胞，收集培養液中的懸浮細胞，可篩選出高純度的DCs。對于誘導體系所采用的細胞因子濃度，不同的文獻報道差異較大，本實驗在培養過程中發現，在rmGM-CSF濃度為20 ng／ml時DCs即可有比較滿意的獲得率，隨著細胞因子濃度的增加，DCs的獲得率并沒有明顯增加，而當rmGM-CSF濃度達到100 ng／ml時，imDCs培養體系中imDCs所占的比例反而減少，mDCs所占比例增加，該結果與先前的文獻［4－5］報道一致。

DCs通過不同的成熟狀態改變細胞表面分子的表達及細胞因子的分泌，調節抗原特異性T細胞向不同亞群分化，參與免疫應答和免疫耐受的發生。其免疫原性和耐受性雙重功能主要與其表達共刺激分子相關，在免疫應答過程中，APC將抗原提呈給T淋巴細胞需要兩個信號的參與，第一信號由APC表面的抗原肽-MHCII類分子復合物與TCR相互作用，誘導T淋巴細胞的活化，第二信號則是由CD80、CD86等協同刺激分子共同調節T淋巴細胞的增殖活化［6］。本研究顯示，imDCs組中CD80、CD86等協同刺激分子和MHC-Ⅱ類分子呈現出低表達，抗原提呈能力較弱，T淋巴細胞活化信號受阻，此時的DCs表現為免疫耐受狀態，而在mDCs組中CD80、CD86等協同刺激分子和MHC-Ⅱ類分子表達明顯升高，MLR實驗顯示，mDCs對同種異基因的T細胞刺激能力明顯高于imDCs。刺激成熟后的DCs調節T淋巴細胞的活化，參與機體免疫應答，而未刺激成熟的DCs在體內下調免疫應答和維持免疫耐受，又稱之為耐受性樹突狀細胞（tolerogenic dendritic cells，tolDCs）。本實驗從細胞形態、分子表達和MLR三個方面鑒定培養體系中imDCs和mDCs的形態和功能特點，可以判定培養出的DCs符合科研要求。

有文獻［7］報道，盡管在人和老鼠的正常動脈上也能發現DCs，但當這些血管發生動脈粥樣硬化時，DCs在數量和分布上會發生很大的改變。本課題組的前期研究［8］顯示，在人頸動脈粥樣硬化血管中免疫原性的CD83＋mDCs的分布增多，而耐受性的CD11b＋tolDCs分布減少。由此可見，DCs的免疫調節作用參與了AS的發生和發展，然而DCs在體內的數量較少，僅占外周單核細胞的1%左右［9］，如此稀少的數量給其免疫功能的研究帶來了不小的困難。因此，本實驗利用rmGM-CSF及rm IL-4從小鼠骨髓細胞中誘導培養出大量可供研究的DCs，為后續在AS小鼠模型上進行其免疫功能研究創造了有利的條件。

［1］ 任 濤，李枚娟，王 焱.動脈粥樣硬化與炎癥反應關系的研究進展［J］.中國老年學雜志，2010，30（10）：1464－7.

［2］ 滕廣帥，邵宗鴻.樹突細胞與自身免疫性疾病關系的研究進展［J］.中華醫學雜志，2012，92（12）：859－61.

［3］ Lutz M B，Kukutsch N，Ogilvie A L，et al.An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bonemarrow［J］.JImmunolMethods，1999，223（1）：77－92.

［4］ 李聞穎，鄧 鋒，王豫蓉，等.不同濃度粒巨噬細胞集落刺激因子在未成熟樹突狀細胞培養中的效果研究［J］.重慶醫科大學學報，2009，34（4）：424－7.

［5］ 王曉婧，梅曉冬.不同濃度粒巨噬細胞集落刺激因子及白介素－4對樹突狀細胞體外誘導培養的影響［J］.中國臨床保健雜志，2014，17（2）：157－9.

［6］ 張安莉，仇 超，徐建青.淋巴細胞膜分子CD160結構與功能的研究進展［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2011，31（4）：380－4.

［7］ Galkina E，Ley K.Immune and inflammatorymechanisms of atherosclerosis［J］.Annual Review of Immunology，2009，27：165－97.

［8］ 鄧 瓊，胡何節，方征東，等.CD83＋成熟樹突狀細胞和CD11b＋耐受性樹突狀細胞在人頸動脈粥樣硬化病變中的分布［J］.中國臨床保健雜志，2014，17（1）：45－7.

［9］ Steinman R M.The dendritic cell system and its role in immunogenicity［J］.Annu Rev Immunol，1991，9：271－96.

A culture system for dendritic cells induced from murine bonemarrow in vitro

Liu Zhenming，Hu Hejie，Fang Zhengdong，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001）

To establish a culture system for dendritic cells（DCs）induced from murine bonemarrow in vitro.Compared with mature DCs，fewer spines were observed in immature DCs under microscopy.The expressions of cell surfacemolecules in immature DCswere significantly lower than those ofmature DCs.MLR indicated T cells proliferation capacities of same-reaction ratio in immature DCs were significantly lower than those in mature DCs.The methods of culturing DCs establised by us can be used in the future experment.

mice；dendritic cells；cell culture

R 654.3

A

1000－1492（2015）08－1177－04

2015－04－14接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085MH151、1408085MH177）

安徽醫科大學附屬省立醫院普通外科，合肥 230001

劉振明，男，碩士研究生；

胡何節，男，主任醫師，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：huhejie＠hotmail.com