流式細胞術檢測HLA-B27對輔助診斷AS作用的評估

張靜 何其瑞 金玉林 周小菊

流式細胞術檢測HLA-B27對輔助診斷AS作用的評估

張靜 何其瑞 金玉林 周小菊

目的 評估流式細胞術HLA-B27檢測對強直性脊柱炎(AS)的臨床診斷價值。方法 對438例均經過X線檢查的患者用流式細胞儀法進行HLA-B27檢測, 計算各項診斷性能指標, 并與X線檢查結果進行比較分析。結果 流式細胞術HLA-B27檢測試驗的靈敏度、特異性、準確度和約登指數分別為89.3%、93.1%、91.3%、0.824。兩種診斷方法差異無統計學意義(P=0.424＞0.05), 而且吻合度較好(к=0.885＞0.7)。另外有7例(3.5%)AS患者X線檢查正常而HLA-B27陽性。結論 流式細胞術HLA-B27檢測對AS的診斷價值較高, 適合于臨床常規檢測。

流式細胞儀；HLA-B27；強直性脊柱炎；X線檢查

HLA-B27基因是HLA-Ⅰ類分子B位點上一個重要的等位基因, 位于人類第6號染色體短臂上。該基因編碼的抗原幾乎表達在所有有核細胞上, 尤其淋巴細胞表面含量最為豐富。HLA-B27分子的免疫功能主要有負責細胞之間的相互識別, 誘導免疫反應和調節免疫應答等。早在1973年Brewerton等就發現HLA-B27表達與AS關系密切［1］。后來的研究證實：HLA-B27抗原表達與AS呈高度相關性, 超過90% AS患者HLA-B27抗原陽性［2-4］, 而正常人群HLA-B27陽性率只有5%左右。迄今為止, 在發現的所有HLA抗原與疾病關聯中, HLA-B27與AS的相關性最強最典型［5］。因此, HLA-B27檢測對AS的臨床診斷和鑒別診斷具有重要意義。本院在2007年開展了HLA-B27流式細胞術檢測技術, 至今已檢測標本3000多例。為評估本院開展的HLA-B27檢測試驗對AS的臨床診斷能力, 作者回顧性研究了本院檢測HLAB27的438例患者病歷資料, 并對相關數據進行統計學分析,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1～7月本院相關科室均經過X線檢查的438例患者, 男323例, 女115例, 年齡14～57歲, 平均年齡(30.1±9.2)歲。其中, 結合臨床癥狀和多種檢測手段最終被醫師確診為AS的患者201例［男163例, 女38例, 平均年齡(26.4±6.1)歲］, 非AS患者237例。

1.2 儀器與試劑 FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司),配套HLA-B27檢測試劑盒(包括Anti-HLA-B27 FITC/CD3, HLA-B27 Calibtation beads for FL1, FACS溶血素等)。

1.3 方法 用EDTA抗凝的真空采血管采集2 ml外周血。取50 μl抗凝全血, 加入30 μl Anti-HLA-B27 FITC/CD3混勻,室溫避光靜置15～30 min。加入2 ml用蒸餾水1∶10稀釋的溶血素, 低速混勻, 室溫避光靜置10～12 min后立即300 g離心5 min, 棄上清。加入2 ml PBS, 混勻靜置5 min, 200 g離心后棄上清。加入0.5 ml PBS, 低速混勻, 固定30 min。對儀器進行調試后啟動軟件進行樣本HLA-B27的自動分析。根據定標微球確定界值, 若樣本FL1平均熒光強度大于或等于界值判斷為陽性, 小于界值為陰性,見圖1, 圖2。

1.4 統計學方法

1.4.1 為評價X線檢查和流式細胞術HLA-B27檢測對AS的診斷價值, 以臨床醫師的最終診斷為金標準, 分別計算該兩種診斷方法的靈敏度、特異性、準確度和約登指數, 計算公式如下：

靈敏度=［TP/(TP+FN)］×100% (TP:真陽性數, FN：假陰性數)

特異性=［TN/(TN+FP)］×100% (TN:真陰性數, FP：假陽性數)

準確度=［(TP+TN)/(TP+TN+FN+FP)］ ×100%約登指數=靈敏度+特異性-1

1.4.2 用SPSS19.0統計學軟件對數據進行配對資料McNemar檢驗, 一致性檢驗采用к系數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義, к≥0.7表示吻合度較強。

2 結果

2.1 201例確診的AS患者中HLA-B27陽性者有184例,陽性率為91.5%。237例非AS患者中HLA-B27陽性者有16例, 陽性率為6.8%。兩種方法各項診斷性能指標見表1。

圖1 HLA-B27陽性標本

圖2 HLA-B27陰性標本

2.2 用流式細胞術對438例患者進行HLA-B27的檢測結果與X線檢查比較, 差異無統計學意義(P=0.424＞0.05)；к=0.885＞0.7,說明兩種方法具有較強的吻合性, 見表2。

表1 X線和HLA-B27檢測方法的靈敏度、特異性、準確度和約登指數(n, %)

表2 438例疑似患者HLA-B27檢測和X線檢查結果比較(n)

3 討論

AS是一種主要累及脊柱、骶髂關節的慢性進行性疾病,發病較為隱匿。AS多見于15～30歲的男性青少年, 男女比例約為3：1［6,7］［本次調查研究AS平均發病年齡(26.4±6.1)歲, 男女患病比例約為4.3：1］。雖然其確切病因和發病機制尚不十分清楚, 但許多研究表明遺傳和環境因素起著至關重要的作用。臨床診斷AS主要依靠臨床表現和影像學檢查,如X線、CT和MRI等。但由于CT和MRI價格昂貴等原因, X線檢查仍是該病的基礎診斷方法。中晚期出現骶髂關節炎時, X線顯示關節邊緣模糊, 并稍致密, 關節間隙加寬等。但在發病初期骶髂關節炎的這些表現并不明顯, 因此早期單靠X線難以確診。

HLA-B27抗原是強直性脊柱炎的一個重要遺傳標記。多項家族調查研究也發現B27是重要的AS預判指標, 因為B27陰性個體患AS的幾率幾乎為零, 而陽性個體患病幾率達到20%～30%［8-10］。因此, HLA-B27可以作為常規篩選指標,對AS的診斷、預防和預后判斷都有重要意義。目前HLA-B27的常用檢測方法有ELISA、補體依賴的微量淋巴細胞毒試驗、PCR和流式細胞儀法等。其中, 流式細胞儀法自動化程度高,操作簡便, 重復性好, 結果判斷準確, 是目前比較理想的檢測方法。BD公司的一份流式細胞術臨床研究手冊表明用流式細胞儀來檢測HLA-B27表達的特異性高達97.4%。

本實驗采用流式法對438例患者進行HLA-B27檢測,結果顯示201例AS患者中HLA-B27陽性率為91.5%, 而非AS人群中HLA-B27陽性率僅為6.8%, 與以前的文獻報道相近［2-4］, 強烈提示HLA-B27抗原表達與AS密切相關。經計算流式法 HLA-B27檢測的靈敏度、特異性、準確度和約登指數分別為89.3%、93.1%、91.3%、0.824,各項性能指標的整體水平較好, 說明HLA-B27檢測對AS的檢出能力較高。經配對資料McNemar檢驗, P＞0.05, 兩種方法檢出率差異無統計學意義, 另外經к系數檢驗, к=0.885＞0.7, 說明兩種方法具有較好的符合率。

另外作者發現確診的AS患者中有7例(3.5%)X線檢查正常, 但HLA-B27檢測陽性, 這表明并行HLA-B27檢測具有重要的臨床意義, 是十分必要的。

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Evaluation of HLA-B27 detection by flow-cytometry for effect of assisted diagnosis of AS

ZHANG Jing, HE Qi-rui, JIN Yu-lin, et al.
Department of Blood Transfusion, Xinyang City Central Hospital, Xinyang 464000, China

Objective To evaluate the clinical diagnosis value of HLA-B27 detection by flowcytometry for ankylosing spondylitis (AS).Methods Flow-cytometry was applied for 438 patients under X-ray examination to detect their HLA-B27.Indicators of diagnostic performance were calculated, and were compared with X-ray examination outcomes.Results The sensitivity, specificity, accuracy, and Youden index of flow-cytometry in detection of HLA-B27 were respectively 89.3%, 93.1%, 91.3%, and 0.824.There was no statistically significant difference between these two diagnosis methods (P=0.424＞0.05), and both methods had good coincidence rate (к=0.885＞0.7).There were another 7 cases (3.5%) with AS had normal result in X-ray examination along with positive HLA-B27.Conclusion Flow-cytometry provides high diagnostic value for AS through its detection of HLA-B27, and it is worth being applied in clinically conventional detection.

Flow-cytometry; HLA-B27; Ankylosing spondylitis; X-ray examination

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.11.008

2014-11-21］

464000 信陽市中心醫院輸血科