4個Y-miniSTR基因座熒光標記復合擴增體系的建立

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4個Y-miniSTR基因座熒光標記復合擴增體系的建立

王惠1，白小剛1，夏昱1，李慶慶1，何望2，梁偉波2

(1.成都市公安局刑偵局，四川成都610081;2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院法醫物證學教研室，四川成都610041)

【摘要】目的:構建DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4等4個Y-miniSTR基因座復合擴增體系，評價其檢測敏感度、數據庫兼容性和對降解檢材的分型能力。方法:設計4個Y-miniSTR的引物，用FAM、JOE、ROX、TAMRA分別標記其上游引物，構建復合擴增體系。利用本體系的引物擴增稀釋過的Y23試劑盒的ladder，制備等位基因分型標準物。比較該體系與Promega PowerPlex?Y23試劑盒在普通檢材、降解檢材的分型能力、敏感度和分型結果。結果:同一樣本體系分型結果和商業化試劑盒Y23 STR分型結果相同，4個Y-miniSTR復合擴增體系和對降解檢材的分型成功率更高，敏感度一致，具有數據庫兼容性。結論:本研究中的4個Y-miniSTR復合擴增體系對降解檢材的檢測具有應用價值，敏感性較好，具有數據庫兼容性，可以作為對降解檢材分型時商業化試劑盒的補充。

【關鍵詞】法醫物證學;復合擴增體系; miniSTR; Y染色體;降解DNA;低模版DNA

短串聯重復序列(short tandem repeats，STR)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態性的DNA序列，由2～6 bp順序相同的重復序列單位首尾串聯重復排列組成。目前，STR分型是國內外法醫個人識別和親權鑒定的最主要的手段。

Y染色體短串聯重復序列(Y-STR)由于其單倍型父系遺傳特點，在法醫學和群體遺傳學中具有重要而獨特的作用［1］。在法醫學個人識別、親權鑒定中，對于各種形式的混合斑如精液與陰道液，含有男性成分的體液斑等的檢驗中［2］，可直接檢測Y-STR確定男性個體;在假設父缺席時可借助男系的男性親屬對男性的子代進行親權鑒定。因此Y-STR越來越受到法醫學工作者的重視［3］。

在實際檢案過程中，檢材所處環境復雜，不利于DNA的保存。在應用商品化STR試劑盒進行DNA分型時可能出現優勢擴增或者無效擴增，無法獲得合格的分型結果，進行高度降解的DNA的STR分型成為法醫檢驗的難點［4］。mini-STR技術即設計引物時盡量縮小擴增子的長度［5］，在高降解檢材STR分型中逐漸受到研究者的重視［6］。

本研究旨在建立新型的4個Y-miniSTR基因座熒光標記復合擴增體系，并對其法醫學應用進行初步研究。

1　材料和方法

1.1DNA制備

12份中國漢族健康無關男性個體血液樣本來自四川大學華西法醫鑒定中心，其中3份使用酚氯仿法(試劑購于成都瑞信生物公司)提取DNA，剩余9份使用百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop1000紫外分光光度計對DNA進行定量。

利用酚氯仿法提取的3份DNA進行超聲波降解制作高降解DNA。使用寧波新芝JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，超聲10 s，間隔4 s，功率500 W，分別超聲100次，200次，300次，400次。

1.2引物設計及合成

引物序列來源于NIST網站(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/)，由Invitrogen公司合成。引物序列等詳情見表1，表2。

表1　引物序列及熒光標記

表2　擴增子長度及引物濃度

1.3PCR擴增體系及熱循環參數

本體系使用QIAGEN-Multiplex試劑盒進行復合擴增。擴增體積10 μL，擴增使用東勝EDC-810基因擴增儀。DNA模版1 ng，混合引物(表2)2 μL，2x Master Mix 5 μL，PCR擴增水補齊至10 μL。復合擴增參數:95℃預變性15 min: 30次循環(94℃30 s，60℃90 s，72℃60 s);60℃延伸30 min，4℃保存。

PowerPlex Y23擴增條件為，擴增體積10 μL，擴增使用東勝EDC-810基因擴增儀。DNA模版1 ng，5x Master Mix 2 μL，10x Primer Pair Mix 1 μL，PCR擴增水補齊至10 μL。復合擴增參數: 96℃預變形2 min，30次循環(94℃10 s，61℃1 min，70℃30 s)，60℃延伸20 min，4℃保存。

1.4毛細管電泳分型

本體系PCR產物利用ABI3130遺傳分析儀檢測分析。本體系PCR產物1 μL，AGCU-SIZ500內標0.15 μL，Hi-Di formamide 8.85 μL，混勻編號，95℃變性后放入自動進樣盤。電進樣15 KV、5 s，電泳28 min。Data Collection軟件收集數據，GeneMapper-ID V3.2軟件進行分型。Y23試劑盒PCR產物按照說明書使用ABI3130進行操作，GeneMapperID V3.2軟件進行分型。

2　結果

2.1一致性分析

本實驗中12份人血DNA，2 800 M標準DNA 的STR分型結果和Y23試劑盒相同，本體系2 800 M標準DNA分型圖見圖1。

圖1　本體系2 800 M標準DNA分型結果

2.2低模版DNA分型結果

對不同濃度的2 800 M DNA進行STR分型，Y23試劑盒最低可對模版量為50 pg的DNA成功分型;本體系最低可對模版量為50 pg的DNA成功分型，平均峰高比Y23試劑盒結果更高。出峰數、平均峰高等詳見表3。

表3　低模版DNA分型結果

2.3降解檢材分型結果

對超聲降解樣本進行STR分型，Y23試劑盒在超聲100次及200次成功分型，超聲300次及400次的樣本時出現大片段等位基因丟失現象;本體系僅在一個樣本400次超聲降解DNA的DYS439出現等位基因丟失，其余都能成功分型，平均峰高比Y23試劑盒更高，出峰數、峰高等詳見表4，分型圖見圖2、圖3。

表4　超聲降解檢材分型結果

圖2　Y23-300次超聲分型結果

圖3　本體系-400次超聲分型結果

3　討論

mini-STR技術即設計引物時，使其盡可能結合在更靠近核心重復序列的側翼序列，使PCR擴增產物盡可能縮短，對降解的DNA小片段分型成功率相對更高［7］。如果miniSTR基因座是商品化試劑盒中的STR基因座，這些miniSTR基因座具有一個很明顯的優勢:數據庫兼容性。在法醫現場工作中收集到的降解DNA樣品，用miniSTR技術進行DNA分型，結果可以與用商品化STR試劑盒做出的犯罪嫌疑人結果進行比較，從而認定罪犯。本研究著重于Y-STR位點，和常染色體STR位點相比，Y-STR位于Y染色體特異區，呈穩定的父系遺傳，除突變外，父親的Y-STR特征將毫無變化地傳給兒子，使其在混合斑鑒定、父系親屬間親權鑒定和群體遺傳學中有重要作用。單獨檢測Y-STR，即可獲得混合斑中的男性成分的信息;利用Y染色體呈整體單倍型父子遺傳的特性進行父子之間的親權鑒定，可大大提高親權指數;由于Y染色體的特殊性，Y-STR多態分布具有顯著的人群、地域分布特征，不同種族、民族和不同地域甚至不同家族的Y-STR具有明顯差異性。通過對這種差異的分析，可直接反映出人群或種族父系歷史，可提示嫌疑人的群體來源背景。這種差異還有望用于涉及法律的移民問題和親緣關系的鑒定，以及不同種族、民族、不同區域人群的鑒定。

在本研究中，同一樣本本體系分型結果和商業化試劑盒Y23［8］STR分型結果相同，擴增子長度符合理論計算，無非特異性擴增，說明本體系引物設計正確;對低模版檢材進行分型時，Y23試劑盒可對模版量最低為50 pg的樣本成功分型，本體系可對模版量最低為50 pg的樣本成功分型，說明本體系反應條件優化良好，對DNA模版量要求不高，有利于實際檢案的使用;對高降解檢材進行分型時，Y23試劑盒在300次超聲及以上的DNA樣本無法成功分型，而本體系能對300次超聲的樣本成功分型，400次超聲的樣本僅在一個樣本中丟失一個位點，本體系對降解檢材的STR分型能力高于Y23試劑盒，在實際檢案面臨降解DNA時，本體系可作為對Y23試劑盒的補充，對Y23試劑盒不能成功分型的4個大片段STR位點進行分型。目前商業化的miniSTR試劑盒有中德美聯AGCU + mini，Applied Biosystems AmpFlSTRminifiler。AGCU mini試劑盒包括Amelogenin，D19S253、Penta D、Penta E、D2S1338、D19S433、CSF1PO、D12S391、D6S1043等9個位點，AmpFlSTRminifiler包括Amelogenin、D13S317、D7S820、D2S1338、D21S11、D16S539、D18S51、CSF1PO、FGA。這兩個試劑盒都沒有包含Y-miniSTR位點。有研究認為，AGCU mini和Mini-FIler在10 μL體系中能對40 pg以上的模版成功分型［9-10］，本研究中的Y-miniSTR體系可對模板量50 pg以上的樣本成功分型。法醫學者對常染色體和X染色體上的miniSTR進行了大量研究，Israr等［11］進行了12個X-miniSTR的研究，Wang等［12］進行了常染色體STR的研究。Y-miniSTR的研究較少，位點集中在商業化試劑盒中未出現的位點，不具有數據庫兼容性，位點等位基因數少，多態信息量一般。本文中選取的位點是商業試劑盒中的位點，有良好的數據庫兼容性，位點等位基因數較多，多態信息量更好，研究者們進行了大量群體遺傳學調查，在YHRD(Y Chromosome Haplotype Reference Database，www.yhrd.org)數據庫中有著大量Y23的群體遺傳學數據。

本文建立了新型的4個熒光標記Y-miniSTR復合擴增體系，4個位點為DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4，都是存在于Y23試劑盒中的位點，擴增產物在81～44 bp之間，并對其法醫學應用進行初步研究。通過和商業化試劑盒Y23同一樣本分型結果的對比，顯示分型結果一致;利用超聲降解制備降解DNA，在300次超聲及以上的降解DNA分型時，本體系和Y23試劑盒相比有著更好的分型成功率;在低模版DNA的STR分型時，本體系和Y23試劑盒檢測靈敏度一致。僅4個位點的復合體系還不足以進行個人識別和親子鑒定，在以后的研究中，將增加位點數，使本體系能夠進行個人識別和親子鑒定。本體系尚未建立MATRIX文件，綠色熒光對藍色和黃色熒光的影響較大，在后續研究中將建立MARIX文件，優化反應條件，提高檢測靈敏度、穩定性和平衡性;并對本系統的多態性、各種法醫學參數、各種不同檢材的適用性進行深入的研究。

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網絡出版時間: 2015-3-5 12∶47網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.002.html

Development of a new quadruplex ChrY miniSTR system

WANG Hui1，BAI Xiao-gang1，XIA Yu1，LI Qing-qing1，HE Wang2，LIANG Wei-bo2

(1.Institute of Forensic Science，Chengdu Public Security Bureau，Chengdu 610081;2.Department of Forensic Biology，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: A quadruplex of primers aimed at 4 Y-chromosomal short tandem repeat(Y-STR)loci(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)was built.The length of 4 amplicons was all shorter than 150bp which was called miniSTR.An examination was carried out for sensitivity，DNA database compatibility and degraded DNA typing ability of the quardplex.Methods: 4 primers of Y-STR(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)were specially selected for short amplicons.The front primer of DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4 was labeled with FAM，JOE，ROX，TAMRA separately.DNA samples were collected from forensic cases.And degraded samples were made by ultrasonic impact treatment.Ladder of the quadruplex was amplified from dilution of Y23 Ladder with the quadruplex primers.The quadruplex was compared to promega Y23 for sensitivity，DNA database compatibility and highly degraded DNA typing ability.Results: Sensitivity of the quardplex was the same as Y23 in both common samples and highly degraded samples.As a result of test on degraded DNA samples using the quadruplex systems，the systems proved to be an more effective tools for analyzing degraded DNAs than Y23.And there were no differences in DNA typing results which means great DNA database compatibility.Conclusion: The quadruplex of Y-miniSTR in addition to the commercial available Y-STR multiplex kits are highly useful for forensic practices of degraded DNA samples.

【Key words】Forensic Genetics; Multiplex kits; MiniSTR; Ychromosome; Degraded DNA; Low temple DNA

通訊作者:梁偉波，E-mail: liangweibo@scu.edu.cn

作者簡介:王惠(1968-)，女，四川古藺人，副主任法醫師，主要從事法醫物證學研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(81471827，81202387);四川省公安廳重點攻關及應用創新項目(201303)

收稿日期:2014-11-14

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.02

【文章編號】1005-3697(2015)01-0006-05

【中圖分類號】D919

【文獻標志碼】A