甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

高曉東，李雪萍，李永輝，張永東，楊 凱，李海寧

1甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000；

2甘肅省醫(yī)學科學研究院轉化醫(yī)學研究中心

甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

高曉東1，李雪萍2△，李永輝2，張永東2，楊 凱2，李海寧2

1甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000；

2甘肅省醫(yī)學科學研究院轉化醫(yī)學研究中心

目的：觀察甘肅金銀花（盤葉忍冬）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的體內、外抗菌作用。方法：體內抗菌用金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠，觀測給藥小鼠在染菌后7天內的死亡率；體外抗菌用瓊脂擴散實驗和菌落計數(shù)法測定最小抑菌濃度（M IC）和抑菌圈大小。結果：對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花（盤葉忍冬）后小鼠的死亡率分別為45%和40%；正品金銀花為40%；兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。體外抗菌實驗測得甘肅金銀花（盤葉忍冬）和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 m g/m L和12.5 m g/m L。結論：甘肅金銀花（盤葉忍冬）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有一定的體、內外抗菌作用。

甘肅金銀花（盤葉忍冬）；體內外抗菌；金黃色葡萄球菌；大腸埃希菌

盤葉忍冬(Lonicera tragophylla Hemsl.)屬忍冬科忍冬屬落葉藤本,具有清熱解毒、涼風散熱之功效。臨床上廣泛用于急性熱病及外科感染性疾病,如上呼吸道感染、急性扁桃體炎等［1-4］。本研究對甘肅金銀花（盤葉忍冬）在抗炎、解熱鎮(zhèn)痛方面進行研究，取得了一定成果，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物 甘肅金銀花（盤葉忍冬）水提濃縮物由甘肅省醫(yī)學科學研究院藥理毒理實驗中心制備，藥液濃度按生藥量計算為2.63 g/mL，實驗前用滅菌蒸餾水稀釋成所需濃度。正品金銀花購自甘肅省黃河藥市，產(chǎn)地：山東，濃縮液制備同甘肅金銀花。雙黃連口服液(哈藥集團三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：13051324)。

1.2 動物 昆明種小鼠，SPF級，體質量18～22g，雌雄兼有，由甘肅省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(甘)2006-0010。

1.3 菌株來源 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸埃希菌（CCTCCAB200068）均由甘肅省醫(yī)學科學研究院醫(yī)學生物中心提供。

1.4 試劑與儀器 BUCHI461旋轉蒸發(fā)儀(瑞士)；JA-2003電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；ClassⅡ，TypeA2型生物安全柜(力康集團全資附屬公司新儀器上海有限公司)；立式壓力蒸氣滅菌器(LS-B50)；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密儀器廠)。

1.5 方法與步驟

1.5.1 體內抗菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用。選取健康小鼠140只，體質量為18～22 g，雌雄各半，隨機分為7組，即空白對照組、模型對照組、雙黃連組、正品金銀花組，甘肅金銀花(盤葉忍冬)高劑量組(28.8g/kg)、中劑量組(14.4g/kg)、低劑量組(7.2 g/kg)。各組動物按劑量連續(xù)灌胃給藥3天(空白對照組和模型對照組給予等容量蒸餾水，金銀花對照組在感染菌前1天開始給藥)，1次/d。感染前小鼠禁食過夜，第3天給藥后30分鐘，根據(jù)菌株毒力的預實驗情況選用使80%～100%小鼠死亡的金黃色葡萄球菌的干酵母懸液8.6×105cfu/mL (或大腸埃希菌6.1×106cfu/mL)，0.5 mL/只，給小鼠腹腔注射造成感染(空白對照組注射等容量干酵母生理鹽水溶液)。感染后6小時再給藥1次，繼續(xù)給藥1天，觀察和記錄各組動物感染后7天內的反應情況以及死亡數(shù)［5-6］。

1.5.2 體外抑菌實驗 將上述中藥各稱取20 g，加入約5倍量水，浸泡過夜后，文火煮沸30分鐘，過濾后，再加5倍量水，文火煮沸30分鐘，過濾。將2次濾液合并后在文火上濃縮至20 mL，即為100%中藥原液。調pH值為7.6。

1.5.3 菌落計數(shù)法［7-8］將中藥原液105℃，20分鐘滅菌后即為實驗藥液。用接種環(huán)將金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時，傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)18小時，再傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時，用前將菌液濃度1∶1000稀釋。取無菌試管270支，分3組，每管加肉湯培養(yǎng)基1 mL，第1管加所試藥液混勻后，使1～9管均含有倍比稀釋的藥液(即1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024)。第1、2、3、4、5、6、7、8、9管每管加菌液0.05 mL，充分混勻后，37℃培養(yǎng)24小時，觀察結果。藥液對照管以第9管無細菌生長，菌液對照管第10管有細菌生長，實驗方為有效。以能抑制試驗菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度MIC。

1.5.4 瓊脂擴散法［9］每平皿加0.1mL菌液(菌液濃度為1.0×105cfu/mL)，涂布整個培養(yǎng)基表面，37℃吸附30分鐘，然后上面均勻放置4個直徑約為6 mm的無菌不銹鋼牛津杯。然后用移液器在孔中加藥液200 μL；37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時后觀察并記錄抑菌圈的有無及其直徑大小(重復2次，每次做4孔，求直徑的平均值)。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體內抗菌實驗 對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花(盤葉忍冬)后小鼠的死亡率分別為45%和40%；正品金銀花為40%；兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 甘肅金銀花(盤也忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用(n=20)

2.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL。對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小分別為15 mm和19 mm；對大腸埃希菌的抑菌圈大小為16 mm和19 mm，見表2—3。

表2 最小抑菌濃度測定結果 m g/m L

表3 甘肅金銀花(盤葉忍冬)瓊脂擴散法抑菌實驗結果(n=8)

3 討論

3.1 體內抗菌實驗 與空白對照組比較，模型對照組的小鼠死亡率為95.0%(P＜0.01)，表明濃度為8.6×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌(或濃度為6.1×106cfu/mL大腸埃希菌)的干酵母懸液能引起小鼠死亡，造模成功。與模型對照組比較，雙黃連口服液組與正品金銀花組死亡率明顯降低(P＜0.05)；甘肅金銀花(盤葉忍冬)高、中、低各劑量組死亡率明顯降低(P＜0.05)。提示甘肅金銀花(盤葉忍冬)具有對金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌致小鼠感染死亡的保護作用，顯示了一定的體內抗菌作用。體內抗菌實驗主要研究藥物對感染動物的預防和保護作用，因此體內抗菌實驗是最重要的抗菌作用的研究方法，對于研究中藥的抗微生物作用有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的急性死亡期主要集中在48小時之內，之后存活小鼠可逐漸恢復健康。此外，通過死亡小鼠尸體解剖發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌能明顯引起小鼠小腸炎性壞死，大腸埃希菌可致小鼠肺部感染壞死。

3.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有抑制作用，對兩種菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為6.25mg/mL和12.5 mg/mL，與正品金銀花基本一致。較雙黃連口服液對兩種菌的抗菌作用弱，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與空白對照(蒸餾水)比較，其抗菌作用差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

［1］ 申丹，唐仕歡，盧朋，等.《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑》金銀花用藥規(guī)律分析［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(3):10-13.

［2］ 賀偉.金銀花的化學成分及藥理作用研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2007，4(24):8-9.

［3］ 管仲瑩，趙金明，林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(15):150-151.

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［5］ 徐淑云，卞如滾，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：1657-1666.

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［8］ 蘇香萍，龔大春，張亞雄，等.金銀花二氧化碳超臨界萃取物的體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(4)：832-834.

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Experimental Study on Antibacterial Effects of Gansu Honeysuckle

GAO Xiaodong1,LI Xueping2△,LI Yonghui2,ZHANG Yongdong2,YANG Kai2,LI Haining2
1 TCM Department of Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention，
Lanzhou 730000,China；
2 Medical Transformation Research Center of Gansu Provincial Medical and Scientific Academy

Objective:To observe antibacterial effects of Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.)on Staphylococcus aureus(SA)and E.coli in vivo and vitro.Methods:Mortality rate of the medicated mice were detected in seven days after the mice were infected by SA and E.coli;minimal inhibitory concentration(MIC)and the size of inhibition zone were measured through agar diffusion experiments and bacterial colony counting method.Results: SA-infected and E.coli-infected mice were treated by Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle,mortality rates of SA-infected and E.coli-infected mice treated by Gansu honeysuckle were 45%and 40%respectively;mortality rate of genuine honeysuckle was 40%;the difference was significant when both were compared with model control group with the mortality rate 95%(P＜0.05).The results of antibacterial test showed that MIC of Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle against SA and E.coli were 6.25 and 12.5 mg/mL.Conclusion:Gansu honeysuckle shows antibacterial effects to SA and E.coli in vivo and vitro to a certain degree.

Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.);antibacterial effects in vivo and vitro;SA;E.coli

R284.1

A

1004-6852(2015)11-0017-03

2014-12-15

高曉東(1964—)，男，副主任醫(yī)師。研究方向：中藥藥理。

△通訊作者：李雪萍(1964—)，女，副主任檢驗師。研究方向：中藥藥理。