不同大孔吸附樹脂對葛根總黃酮分離純化效果的影響*

王海峰，張 紅

1武警工程大學醫院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫藥研究院

不同大孔吸附樹脂對葛根總黃酮分離純化效果的影響*

王海峰1，張 紅2

1武警工程大學醫院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫藥研究院

目的：考察三種大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的吸附及解吸性能，為分離純化葛根總黃酮提供選擇依據。方法：以葛根總黃酮為篩選指標，考察A B-8、N K A和X-5三種大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附量和解吸率。結果：以A B-8樹脂為吸附劑。最佳分離條件為上樣濃度：1 g/m L(按生藥計算)，流速：2～3 m L/m i n，70%乙醇為洗脫劑，用量為2.5 BV，總黃酮得率76.22%。結果：A B-8大孔吸附樹脂可用于分離純化葛根總黃酮，總黃酮得率76.22%。結論：三種大孔吸附樹脂相比較，以A B-8為分離純化葛根總黃酮的最佳吸附劑。

葛根總黃酮；葛根素；大孔吸附樹脂

葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)是豆科落葉藤本植物野葛根，最早載于《神農本草經》，性平，味甘辛，功效解肌退熱，生津止渴，升陽透疹［1］。藥理研究發現葛根具有抗缺氧，改善腦循環，保護心肌缺血，降血壓等作用［1-4］。臨床主要用于急性腦梗塞，急性心肌梗塞，不穩定性心絞痛，高粘血癥的治療［5-8］。葛根含黃酮類化合物高達7.6%，主要有葛根素、大豆素、大豆素4′，7-二葡萄糖苷黃豆苷等［9-10］。本研究采用葛根70%乙醇回流得到粗提液為原料，比較AB-8、NKA-9和X-5三種大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的分離效果，并考察AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的工藝和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 葛根采自陜西省安康市鎮平縣。葛根素標準品購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511；AB-8、NKA及X-5大孔吸附樹脂購于天津南開大學化工廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器 UV-2201型紫外分光光度計；層析柱(φ15 mm×200 cm)。

1.3 方法

1.3.1 葛根粗提液制備 將葛根藥材(300 g)烘干，粉碎成粗粉，采用30%乙醇為溶劑回流提取3次，1.5h/次，濾過，濾液合并，減壓濃縮至300mL，得到葛根粗提液。

1.3.2 葛根總黃酮含量測定 以葛根素為對照品，采用紫外分光光度法測定葛根總黃酮含量。

1.3.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素4.88 mg，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(含葛根素0.1952mg/mL)。精密量取儲備液 0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mL，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇稀至刻度，搖勻。分別于254 nm波長處測定吸光度，并建立濃度對吸光度的線性回歸方程：A=62.216C+ 0.0043；相關系數r=0.999 7，見圖1。

圖1 標準曲線

1.3.2.2 含量測定 取葛根粗提液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。另取1.0 mL乙醇同法稀釋作空白對照，在254 nm波長處測定吸光度。計算葛根總黃酮的含量，結果為3.997 mg/mL。

1.3.3 3種大孔吸附樹脂吸附性能的比較(柱層析分離純化)

1.3.3.1 大孔吸附樹脂預處理 AB-8、NKA和X-5 3種樹脂各取100 g，加95%乙醇適量，浸泡3天，讓樹脂充分溶脹，然后用95%乙醇洗脫至流出液中加水后無白色渾濁出現，再用蒸餾水洗盡乙醇，備用。

1.3.3.2 吸附量與解吸率測定 精密稱取預處理過的樹脂5 g，置于三角瓶中，精密加入葛根粗提液50 mL，振蕩24小時，濾過，測定濾液中總黃酮濃度。計算3種樹脂的吸附量和吸附率。再向吸附的樹脂中精密加入95%乙醇50 mL，振蕩24小時，濾過，測定濾液中總黃酮濃度，根據總黃酮解吸量計算解吸率。

2 結果

2.1 吸附量與解吸率測定結果 標準曲線的建立以“1.3.2.1”項下方法繪制標準曲線，建立總黃酮濃度對吸光度的線性回歸方程：A=66.163C+ 0.043 5；r=0.999 5，計算吸附量和解吸率。實驗結果可見3種樹脂中，AB-8大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附量和解吸率最大，見表1。

表1 3種樹脂對葛根總黃酮的吸附量與解吸率測定 m g

2.2 A B-8大孔樹脂對葛根總黃酮的分離純化

2.2.1 吸附流速對吸附效果的影響 吸附流速對吸附效果的影響主要是影響溶質向樹脂表面的擴散。如果流速太高，溶質分子來不及擴散到樹脂表面，就會發生漏過。對相同的葛根浸提液(50mL)在相同條件下，分別進行了AB-8樹脂在吸附流速為小流速(2～3 mL/min)，中檔流速(4～5 mL/min)、最高流速(6～7 mL/min)的吸附實驗，結果表明流速為2～3 mL/min時黃酮洗脫量最大，見表2。

表2 吸附流速對吸附效果的影響

2.2.2 洗脫劑及洗脫濃度的選擇 取AB-8樹脂，濕法裝柱(徑高比1∶15)，準確吸取50 mL樣品原液，以流速1 mL/min上柱，分別準確配制30%、50%、70%、80%和90%的乙醇洗脫劑，檢測它們在相同條件下通過樹脂柱時的解吸率，實驗發現70%以下乙醇洗脫曲線光滑，無拖尾，其解吸率適中，因此選用70%乙醇洗脫，見表3，洗脫曲線見圖2。

表3 不同濃度乙醇洗脫劑對吸附效果的影響

2.2.3 洗脫劑用量的選擇 用AB-8大孔樹脂(樹脂體積25 mL)飽和吸附葛根粗提液，分別用60、90、120、150、180、200、240、270 mL 70%的乙醇洗脫，收集每一樹脂流出液體積，計算黃酮洗脫率，依據累積洗脫率確定70%乙醇用量，見表4。

表4 洗脫劑用量考察結果

實驗發現當洗脫劑用量大于8倍樹脂體積得到的黃酮量少，因70%乙醇用量是樹脂體積5倍時洗脫率累積達到76.22%，說明此時大孔樹脂吸附的黃酮已基本被洗脫下來，并且在其用量為4倍樹脂體積時洗脫率為58.55%。當70%乙醇用量為樹脂體積5～8倍時，黃酮洗脫率的累積值較小，說明70%乙醇用量大于5倍樹脂體積得到的黃酮量少，因此確定體積分數70%乙醇的最適宜用量為5倍樹脂體積。

圖2 不同濃度乙醇洗脫劑的洗脫曲線

3 結論

大孔樹脂(macroporous resin)是以苯乙烯和丙酸酯為單體，加入乙烯苯為交聯劑，甲苯、二甲苯為致孔劑，經聚合反應制備而成。聚合物形成后，除去致孔劑，樹脂中留下了大小不一、形狀各異、互相貫通的孔洞。是分離中草藥水溶性成分的一種有效方法［11］。

3種樹脂中AB-8對葛根總黃酮和葛根素具有較高的吸附量，對葛根總黃酮的解吸率超過75%，可用于葛根總黃酮的分離純化。通過動態吸附、解吸的方法，以總黃酮吸附率和解吸率為評價指標，對AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮效果影響的最佳條件為：以70%乙醇為洗脫劑、用量為樹脂體積的5倍，吸附流速2～3 mL/min。葛根總黃酮收率為76.22%，表明AB-8大孔樹脂純化法能夠富集葛根黃酮，適合于葛根黃酮的純化。

［1］ 徐國鈞，何宏賢.中國藥材學［M］.北京:中國醫藥科技出版社，1996:249.

［2］ 韋正友，湯泉，焦東桂，等.葛根素對常壓密閉條件下小鼠的抗缺氧作用［J］.基層中藥雜志，1997，11(4):43-44.

［3］ 劉啟功，王琳.葛根素對心肌梗塞犬冠脈側枝循環的影響［J］.中國中藥雜志，1999，24(5):304-306.

［4］ 黃兆銓，葉武.葛根素對高血壓患者血漿內皮素和一氧化氮的影響［J］.中國現代應用藥學雜志，1999，16(3):13-15.

［5］ 馬琳，何婭.葛根素注射液治療急性腦梗塞68例［J］.陜西中醫，1999，20(1):11.

［6］ 李淑梅，劉斌，陳海芬，等.葛根素注射液對急性心肌梗塞患者血漿內皮素及腎素血管緊張素系統的影響［J］.中國中西醫結合雜志，1997，17(6):339-341.

［7］ 趙志明，楊曉英.葛根素治療不穩定性心絞痛的臨床研究［J］.中國中西醫結合雜志，1998，18(5):282-284.

［8］ 劉艷娟，吳漢卿.葛根素注射液治療高粘血癥的臨床觀察［J］.中國中醫藥科技，1999，6(2):115-116.

［9］ 許永興，瞿海斌，陳赟.葛根素大孔吸附樹脂層析分離動力學［J］.高校化學工程學報，2005，19(6):29-34.

［10］馬振山.大孔吸附樹脂在藥學領域中的研究應用［J］.中成藥，1997，19(12):40-41.

［11］李劍君，李穩高，高新，等.A B-8型大孔吸附樹脂吸附葛根素過程的研究［J］.西安交通大學學報，2000，34(4):78-81.

Influence of Macroporous Adsorption Resin on Purification of Total Flavonoids from GeGen

WANG Haifeng1,ZHANG Hong2
1 Hospital Affiliated to Engineering University of CAPF,Xi′an 710086,China;
2 Shaanxi Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide reference for purifying total flavonoids from GeGen［Puerariae lobata(Willd.) ohwi］by observing adsorption and desorption of macroporous absorption resin to total flavonoids from GeGen. Methods:By taking total flavonoids from GeGen as screening index,adsorption volume and desorption rate of total flavonoids from GeGen were investigated by three kinds of macroporous adsorption resins AB-8,NKA and X-5.Results:AB-8 resin was taken as adsorbent.The optimal separation conditions were sample concentrations:1 g/mL(calculated according to crude drugs),flow rate:2～3 mL/min,70%ethanol as eluent,dosage:2.5BV,total flavonoids yield was 76.22%.Conclusion:AB-8 is chosen as the best adsorbent of separating and purifying total flavonoids from GeGen after comparing three kinds of macroporous absorption resins.

total flavonoids from GeGen;puerarin;macroporous absorption resin

R567.1

A

1004-6852(2015)11-0027-03

2014-11-29

西安市科技計劃項目［編號 SF0931(1)］。

王海峰(1976—)，男，主管藥師。研究方向：中藥藥劑學。