不同精粗比顆粒飼料對斷奶公犢牛瘤胃發酵參數和微生物的影響

楊宏波，劉紅，占今舜，林淼，趙國琦

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

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不同精粗比顆粒飼料對斷奶公犢牛瘤胃發酵參數和微生物的影響

楊宏波，劉紅，占今舜，林淼，趙國琦*

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

本試驗旨在研究不同精粗比顆粒飼料對中國荷斯坦斷奶公犢牛瘤胃微生物蛋白、發酵參數和微生物數量的影響。選用12頭3月齡大的中國荷斯坦斷奶公犢牛，按照日齡相近(103.92±1.5 d)、體重相似(121.25±4.12 kg)的原則隨機分成4組，每組3頭，分別飼喂精粗比為75∶25(Ⅰ)、70∶30(Ⅱ)、65∶35(Ⅲ)、60∶40(Ⅳ)的4種全價顆粒飼料。預試期14 d，正試期56 d。測定犢牛瘤胃微生物蛋白、發酵參數和微生物數量。結果表明，處理組Ⅳ的總揮發性脂肪酸和乙酸濃度最低，且顯著低于處理組Ⅰ(P<0.05)；處理組Ⅳ的丁酸濃度最高，且顯著高于處理組Ⅰ、Ⅲ(P<0.05)；處理組Ⅲ的乙酸/丙酸最大，且顯著大于處理組Ⅳ(P<0.05)。處理組Ⅳ的白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和真菌的相對表達量最高，且顯著高于其他各處理組(P<0.05)；處理組Ⅲ的黃色瘤胃球菌的相對表達量最高，且顯著高于其他各處理組(P<0.05)。綜上所述，高精料全價顆粒飼料雖然能提高犢牛瘤胃總揮發性脂肪酸和乙酸的水平，但會抑制瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌的生長。

顆粒飼料；微生物蛋白；瘤胃發酵；瘤胃微生物；犢牛

斷奶后3～6月齡是犢牛生長發育最強烈的時期，犢牛不僅體重逐漸增加，同時消化器官也在快速發育，各種代謝特征發生變化。因此，這時期的犢牛日糧極為重要，不同精粗比和結構的日糧對犢牛的發育及瘤胃內環境都會產生不同的影響。

瘤胃是反芻動物最主要的消化器官之一，成年動物主要靠瘤胃中纖毛蟲、細菌和真菌等微生物作用，產生揮發性脂肪酸并合成微生物蛋白，為機體提供能量和蛋白質。瘤胃微生物與動物形成了相互依賴又互相制約的關系，微生物可以幫助動物降解粗飼料，從而為宿主的生長提供能量和營養物質，同時動物也為微生物的生存提供了充足的養分和適宜的環境。

目前對顆粒飼料的研究主要集中在顆粒精料對肉牛[1-3]、奶牛[4-6]和家禽[7-9]的生產性能及飼料轉化率上。然而，研究利用苜蓿(Medicagosativa)和小黑麥(Loliummultiflorum)草粉作為原料制成顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃發酵參數和微生物影響的報道很少[10-16]。因此，研究不同精粗比顆粒飼料對犢牛瘤胃內環境和微生物的影響，對顆粒飼料的運用及推廣是非常重要的。本試驗旨在研究不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃發酵參數和微生物數量的影響，探求不同精粗比顆粒飼料影響斷奶犢牛瘤胃微生物和瘤胃發酵的機理，并制定合理的斷奶犢牛日糧，為科學培育優良青年牛提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1試驗日糧

根據NRC (2001)營養需要配制各試驗組犢牛配方。試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ和試驗組Ⅳ分別飼喂精料與粗料質量比為75∶25，70∶30，65∶35和60∶40的顆粒飼料(以上各數值均按照風干樣重量計算)。4種試驗日糧中粗蛋白、粗脂肪和常量元素等指標一致,能量相近，粗料按照苜蓿和小黑麥3∶1組成。所有原料經粉碎后在揚州大學農牧場采用20型顆粒飼料機組制成。各試驗組顆粒料的配方見表1[10]，營養成分見表2。

1.2試驗設計及飼養管理

試驗于2014年3月至2014年5月在揚州大學實驗農牧場進行。選擇日齡相近(103.92±1.5) d、平均體重為 (121.25±4.12) kg的中國荷斯坦斷奶公犢牛12頭，分為4組，每組3頭，顆粒飼料每天于8:30，14:30，20:30飼喂3次，預試期14 d，正試期 56 d。根據3～6月齡犢牛采食量確定各試驗組的飼喂量，平均每周調整1次飼喂量，并保證每組犢牛的干物質采食量基本一致。試驗期每組犢牛分欄飼養，自由飲水，保證犢牛每天有6～7 h戶外活動時間，每日清晨犢牛飼喂后打掃圈舍，并且每周至少對牛舍消毒2次。

表1 各試驗組顆粒料配方組成(干物質基礎)Table 1 Pellet diet composition of each group (DM basis) %

預混料為每kg日糧提供：鐵90 mg、銅12.5 mg、錳60 mg、鋅100 mg、碘1.5 mg、硒0.3 mg、鈷1.0 mg、維生素A 15000 IU、維生素D 5000 IU、維生素E 50 mg。

Premix provided the following per kilogram of the diet:Fe 90 mg, Cu 12.5 mg, Mn 60 mg, Zn 100 mg, I 1.5 mg, Se 0.3 mg, Co 1.0 mg, VA 15000 IU, VD 5000 IU, VE 50 mg.

1.3瘤胃液樣品的采集與處理

正式實驗后每2周最后1 d，在晨飼后4 h通過口腔采液器(武漢科立博有限公司)從瘤胃不同位點采集50 mL瘤胃液樣(之前的唾液舍棄)，立即測定其pH，經4層紗布過濾搖勻后，分裝于10 mL的離心管中[11]。

1份加入0.5 mol HCl保存于-20℃冰箱中，待測氨態氮(NH3-N)含量；1份添加25%偏磷酸，于-20℃冰箱中用于揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)濃度測定；1份混合12.5%三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)用于瘤胃微生物蛋白(microbial crude protein, MCP)合成分析；另一部分于-80℃超低溫冰箱中保存，用于瘤胃液細菌定量分析，待測細菌包括黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens, RF)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus, RA)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens, BF)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola, PR)和真菌(general fungi)。

1.3.1瘤胃液發酵指標及瘤胃MCP合成測定方法 氨態氮濃度測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法[12]，瘤胃MCP濃度參照凱氏微量定氮法進行測定[13]，VFA含量按照Kristensen[14]所述方法用氣相色譜測定。

表2 各試驗組日糧配方的營養水平 Table 2 Nutrition level of each group

營養水平除能量、鈣、磷、賴氨酸和蛋氨酸外均為實測值。NEL、Ca、P、Lys and Met was a calculated value，while the others were measured values.DM:Dry matter; Ash:Crude ash; CP:Crude protein; EE:Crude fat; NDF:Neutral detergent fiber; ADF:Acid detergent fiber.

1.3.2瘤胃液微生物總DNA的提取與檢驗 瘤胃液樣品于冰上溶解后振搖30次以混合均勻，取200 μL瘤胃液樣品，采用糞便基因組提取試劑盒提取瘤胃液微生物總DNA(Tiangen生物科技有限公司)，提取方法參照試劑盒說明書。用超微量分光光度計(NanoDrop-1000，美國賽默飛世爾科技公司)檢測總DNA的濃度和純度(OD260/280和OD260/230)，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的質量。然后將總DNA于-20℃冰箱中保存備用。

表3 熒光定量PCR引物Table 3 Primers used for real-time PCR quantification

引物設計是基于細菌的16S rRNA基因。Primers were based on 16S rRNA genes for bacterial groups.

1.3.3引物設計與合成 引物參照文獻設計，由Invitrogen公司合成，具體引物序列見表3。

1.3.4瘤胃細菌定量方法 本試驗采用相對定量法[15]對瘤胃液中部分微生物進行定量。

熒光定量PCR分析采用羅氏Light Cycler 96和序列檢測軟件(Version 1.1)進行。每個樣品3個重復，PCR擴增采用20 μL反應體系，體系組成如表4所示。

PCR擴增反應程序為：1)95℃ 預變性30 s；2)95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s并采集熒光信號，共40個循環；3)溶解曲線分析，以20℃/s的速度從95℃降至 65℃，再以20℃/s的速度緩慢加熱至95℃，在95℃保持0 s，在65℃保持15 s，結束時4℃保存。

表4 熒光定量PCR擴增體系Table 4 Realtime PCR reaction system

1.3.5目的基因相對定量的計算 目的基因相對定量用2-ΔΔCt法計算，以瘤胃液總細菌(general bacteria, GB) DNA作為內參基因，用對照組的基因進行校正[16]。熒光定量PCR基因相對表達量表示成目的基因相對于GB的倍數。ΔCt值表示某樣品目的基因臨界循環數(Ct)與內參基因Ct值的差值，而ΔΔCt值表示試驗組樣品平均ΔCt與對照組平均ΔCt的差值。結果以平均倍數±標準誤表示。

1.4數據處理與統計分析

采用SPSS軟件進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行差異顯著者多重比較，以P<0.05作為差異顯著的判斷標準，試驗結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃MCP濃度的影響

由表5可知,不同精粗比顆粒飼料對各處理組瘤胃MCP濃度均無顯著影響(P>0.05)。

表5 不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃微生物蛋白濃度的影響Table 5 Effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratio on rumen microbial proteins (MCP) of weaned bull calves

2.2不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃發酵參數的影響

由表6可知，處理組Ⅳ的總揮發性脂肪酸和乙酸濃度最低，且顯著低于處理組Ⅰ(P<0.05)；處理組Ⅳ的丁酸濃度最高，且顯著高于處理組Ⅰ、Ⅲ(P<0.05)；處理組Ⅲ的乙酸與丙酸比值最大，且顯著大于處理組Ⅳ(P<0.05)。此外，不同精粗比顆粒飼料對各處理組pH、氨態氮、丙酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的濃度無顯著影響(P>0.05)。

2.3不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃細菌的影響

由表7可知，處理組Ⅳ的白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和真菌的相對表達量最高，且顯著高于其他各處理組(P<0.05)；不同精粗比顆粒飼料對各處理組棲瘤胃普雷沃氏菌的數量無顯著影響(P>0.05)；此外，處理組Ⅲ的黃色瘤胃球菌的相對表達量最高，且顯著高于其他各處理組(P<0.05)。

3 討論

3.1不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃MCP濃度的影響

能量和蛋白質是維持瘤胃微生物代謝最主要的營養來源。其中瘤胃微生物是反芻動物最主要的氮源，它能夠為反芻動物提供40%～80%的蛋白需要量[20]。然而，MCP的高產是以瘤胃內氮源和能量的有效同步為基礎的[21]。也有研究表明，瘤胃MCP合成量與瘤胃稀釋率呈正相關[22-23]。魯林等[24]采用單外流連續培養系統研究不同精料水平(20%, 80%)與稀釋率對瘤胃MCP合成效率的影響，研究發現提高精料水平和稀釋率，均能明顯提高瘤胃微生物氮日產生量與微生物蛋白質的合成效率。本研究中，各處理組瘤胃細菌蛋白合成量無顯著差異，可能與各處理組日糧的能量和蛋白供應基本一致有關。

表6 不同精粗比顆粒飼料對斷奶公犢牛瘤胃發酵參數的影響Table 6 Effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratio on rumen fermentation parameter of weaned bull calves

注：同行不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)，下同。

Note:In the same row, values with different lowercases mean significant differences (P<0.05)，the same below.

表7 不同精粗比顆粒飼料對斷奶公犢牛瘤胃細菌相對表達量的影響Table 7 Effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratio on the normalized ratio of rumen bacterias of weaned bull calves

3.2不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃pH是反映瘤胃微生物代謝平衡狀況和瘤胃發酵狀況的綜合指標之一，影響其最主要的一個因素是與反芻活動呈正相關的唾液緩沖液的分泌量[25]。本試驗中，各處理組間的瘤胃pH無顯著差異，雖然各處理組顆粒飼料中粗飼料含量不同，但所有原料經過統一粉碎后制成顆粒，使各組犢牛反芻次數相近而導致進入瘤胃中的唾液量相同，最終使瘤胃pH無顯著差異。日糧中粗蛋白水平和微生物蛋白質的降解是瘤胃NH3-N重要的兩種來源[26]。瘤胃微生物生長所需要的氮主要來源于NH3-N，它為微生物提供18%～100%的氮源[27]。對微生物的生長，瘤胃內NH3-N濃度不宜過高或過低，所以保持最適濃度的NH3-N是保證瘤胃MCP產量最重要的條件。影響瘤胃NH3-N濃度的主要原因是飼料中粗蛋白的水平以及蛋白質的降解速度。Michalski等[28]研究發現，日糧中非纖維性碳水化合物是限制瘤胃微生物對NH3-N利用的主要因素，適當提高日糧中非纖維性碳水化合物的水平，能促進瘤胃微生物對NH3-N的利用。Agle等[29]研究指出，奶牛采食高粗料日糧時會導致瘤胃中氨氮水平的降低，原因是結構性碳水化合物可以降低氨的產量，進而能提高瘤胃微生物對瘤胃中氨的利用率。本實驗各處理組間NH3-N的濃度無顯著差異，原因可能是各組瘤胃MCP合成量相近，微生物對NH3-N的利用率相同引起的。此外，各組顆粒飼料中蛋白水平相近也可能是造成瘤胃NH3-N濃度無顯著差異的原因之一。

揮發性脂肪酸能為動物機體提供70%～80%的可消化能，是反芻動物賴以生存、保持正?；顒拥闹饕茉?，同時它參與各種機體代謝[30]。瘤胃液VFA主要由乙酸、丙酸、丁酸以及少量超過四碳的酸和支鏈脂肪酸組成。通常根據乙、丙、丁酸相對比例的高低，將瘤胃發酵類型分為乙酸發酵、丙酸發酵、丁酸發酵3種，一般用乙酸/丙酸來表示瘤胃發酵類型的變化。有研究表明，日糧精粗比對瘤胃總揮發性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)的產生影響不大[31-32]，然而也有研究發現瘤胃TVFA的產量與日糧精粗比和組成有關[33]。本試驗結果表明，瘤胃TVFA和乙酸的產量隨顆粒飼料中精料水平的降低而減少，原因可能是由于高精料組能為微生物提供更多的可發酵底物而造成的。此外，處理組Ⅳ的乙酸/丙酸與其他處理組相比降低，且丙酸比例與其他處理組相比有增加的趨勢，這說明隨著顆粒飼料中粗料水平的升高，犢牛瘤胃的發酵類型會由乙酸發酵型往丙酸發酵型轉變，這是因為增加日糧中精料水平會降低瘤胃中乙酸濃度，苜蓿的含量逐漸升高且動物采食苜蓿比采食其他干草會產生更多的丙酸[31]。

3.3不同精粗比顆粒飼料對斷奶犢牛瘤胃細菌的影響

Grubb和Dehority[34]研究表明，在干物質采食量相同的條件下，隨著綿羊日糧中精粗比的增大，其中細菌的數量會顯著升高，而纖維降解菌的數量會降低。Leedle和Bryant[35]研究發現，給綿羊分別飼喂精粗比為68∶32和23∶77的兩種日糧，綿羊采食高粗料日糧時，在特異性菌群中纖維分解菌的數量較少，而分解木聚糖和膠質菌的數量較多，兩種日糧中總細菌的數量是沒有差異性的。也有報道稱[36-37]，隨著日糧精粗比的改變，瘤胃纖維降解菌的數量不會產生顯著性的改變。然而本實驗結果表明，瘤胃中黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等纖維分解菌的數量隨著顆粒飼料中粗飼料水平的升高而顯著升高。這與Varel和Dehority[38]的研究結果一致。溶纖維丁酸弧菌不僅有降解纖維物質產生VFA的功能，而且能吸收乙酸轉化成丁酸的作用，因此也可以解釋處理組Ⅳ的乙酸濃度最低而丁酸濃度最高。黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃中主要的纖維降解菌，能產生大量的纖維素酶和半纖維素酶，其中主要為木聚糖酶，從而對纖維的降解起著重要的作用。黃色瘤胃球菌發酵的產物主要為琥珀酸、乙酸和甲酸，還有少量的氫氣、乙醇和乳酸，而白色瘤胃球菌幾乎不產生琥珀酸，但可以產生大量的氫氣和乙醇。處理組Ⅲ的黃色瘤胃球菌的數量顯著高于處理組Ⅳ，這是由于這兩種纖維分解菌具有相互抑制的作用，白色瘤胃球菌可產生細菌素，對黃色瘤胃球菌的生長產生抑制作用[39]，本試驗中處理組Ⅳ的白色瘤胃球菌數量顯著高于處理組Ⅲ，因此導致對處理組Ⅳ的黃色瘤胃球菌生長的抑制作用強于處理組Ⅲ，最終使處理組Ⅳ的黃色瘤胃球菌的數量顯著低于處理組Ⅲ。

棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃中主要蛋白降解菌之一，本實驗中各處理組間的棲瘤胃普雷沃氏菌的數量無顯著差異，這可能是由于各組顆粒飼料中粗蛋白水平一致造成的。此外，各處理組真菌的數量隨著顆粒飼料中粗飼料水平的增加而顯著升高，這說明日糧精粗比過高會顯著抑制瘤胃真菌的生長[40]。原因可能是瘤胃厭氧真菌一般是附著于細胞壁厚、木質化程度較高的組織進行生長[41]，然而木質化程度較高組織的含量會隨著顆粒飼料中粗飼料添加量的升高而增加，所以才會導致真菌數量的顯著升高。

從本試驗結果來看，當犢牛采食等能等蛋的不同精粗比顆粒飼料時，對瘤胃TVFA、乙酸、丁酸和乙酸/丙酸均有顯著影響，其中TVFA、乙酸和乙酸/丙酸基本上表現為隨精料水平的降低而減少。此外，高精料的顆粒飼料對犢牛瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌的生長有顯著的抑制作用。

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Effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratios on rumen fermentation parameters and microorganism abundance in weaned bull calves

YANG Hong-Bo, LIU Hong, ZHAN Jin-Shun, LIN Miao, ZHAO Guo-Qi*

CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

This study was conducted to investigate the effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratios on rumen microbial protein synthesis, fermentation and microorganism abundance in weaned bull calves.A total of 12 healthy, weaned Holstein bull calves (age=103.92±1.5 d; weight=121.25±4.12 kg) were randomly assigned to 4 groups (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ), with 3 calves in each group.The treatment diets were complete-diet pellets with four concentrate-roughage ratios (75∶25, Ⅰ; 70∶30, Ⅱ; 65∶35, Ⅲ; 60∶40, Ⅳ).The experiment ran for 70 days in total, including 14 d for adaptation and 56 d for the trial itself.Rumen microbial protein synthesis, fermentation and microbial abundance were measured.The results showed that total volatile fatty acids (VFA) and acetate concentration in group Ⅳ were the lowest, and were significantly lower than those in groupⅠ(P<0.05).The butyrate level of group Ⅳ was significantly higher than groupsⅠand Ⅲ (P<0.05).Group Ⅲ had the highest A∶P, which was significantly greater than group Ⅳ(P<0.05).The relative abundance ofRuminococcusalbus,Butyrivibriofibrisolvensand general fungi in group Ⅳ was significantly higher than the other three groups (P<0.05).Ruminococcusflavefaciensabundance was the highest in group Ⅲ when compared with the other groups (P<0.05).The results indicate that rumen total VFA and acetate concentration can be increased in high-concentrate groups, while it will inhibit growth of the fibre-adherent rumen bacteria and anaerobic fungi.

pellet feed; microbial protein; fermentation; microorganism; calves

10.11686/cyxb2015022

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-13；改回日期：2015-03-30

江蘇省科技支撐項目(BE2013387)和江蘇省高校優勢學科建設工程項目資助。

楊宏波(1988-)，男，內蒙古包頭人，碩士。E-mail:yanghongbo333@outlook.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:jszhaoguoqi@sohu.com

楊宏波, 劉紅, 占今舜, 林淼, 趙國琦.不同精粗比顆粒飼料對斷奶公犢牛瘤胃發酵參數和微生物的影響.草業學報, 2015, 24(12):131-138.

YANG Hong-Bo, LIU Hong, ZHAN Jin-Shun, LIN Miao, ZHAO Guo-Qi.Effects of diet pellets with different concentrate-roughage ratios on rumen fermentation parameters and microorganism abundance in weaned bull calves.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):131-138.