苜蓿黃酮對體外培養的奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響

蘇效雙，占今舜，詹康，劉明美,2，趙國琦

(1.揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇聯合職業技術學院淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200)

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苜蓿黃酮對體外培養的奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響

蘇效雙1**，占今舜1**，詹康1，劉明美1,2，趙國琦*

(1.揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇聯合職業技術學院淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200)

本試驗旨在研究不同濃度苜蓿黃酮對體外培養奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響。試驗利用含不同濃度0 μg/mL(對照組)、25 μg/mL(試驗Ⅰ)、50 μg/mL(試驗Ⅱ)、75 μg/mL(試驗Ⅲ)、100 μg/mL(試驗Ⅳ)苜蓿黃酮的培養基進行細胞培養。結果表明，1)細胞培養第3天，各組細胞增殖無顯著差異，但第5天試驗Ⅱ～Ⅳ組細胞增殖能力極顯著高于對照組和試驗I組(P<0.01)。2)試驗Ⅱ～Ⅳ組一氧化氮(NO)水平明顯高于對照組與試驗Ⅰ組，且差異極顯著(P<0.01)。試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組的乳酸脫氫酶(LDH)活性顯著低于對照組與試驗Ⅲ組，且差異極顯著(P<0.01)，但對照組與試驗Ⅲ組差異不顯著。3)試驗Ⅳ組細胞內過氧化氫酶(CAT)含量極顯著高于其他各組(P<0.01)，而試驗Ⅲ組丙二醛(MDA)含量極顯著低于其他各組(P<0.01)；試驗Ⅱ和Ⅲ組的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性極顯著高于其他各組(P<0.01)，而各處理組細胞的超氧化物歧化酶(SOD)含量差異不顯著。4)試驗Ⅱ和Ⅲ組細胞p53、Caspase-3、SOCS3和STAT1基因的相對表達量極顯著低于對照組(P<0.01)。因此，苜蓿黃酮能夠促進體外培養奶牛乳腺上皮細胞的增殖，提高細胞抗氧化的能力，抑制細胞凋亡，其中添加濃度為75 μg/mL組效果最好。

苜蓿黃酮；乳腺上皮細胞；抗氧化；細胞增殖

紫花苜蓿具有營養價值高，適口性好，產量高，適應性強等優點，紫花苜蓿的莖、葉中含有50多種豐富的營養物質以及多種生物活性成分，其營養成分比大多數植物都要豐富,有“牧草之王”的美譽[1-2]。黃酮(flavonoids)為苜蓿中生物活性成分之一，其在一定劑量范圍內對畜禽有明顯的提高繁殖力、促進生長、增強機體免疫力和雌激素樣的作用[3]；對人體具有抗病毒、增強心血管功能、增強免疫力、抗腫瘤、抑菌、延緩衰老的作用[4]。細胞培養技術是指從活體內取出與試驗相關細胞或組織，在體外模擬體內生理環境，且建立無菌、適溫和一定營養的條件，使細胞生長和生存并維持其結構與功能完整性的一種方法。該方法的優點在于易于提供性狀相似的試驗對象和耗資少，尤其對于大型經濟動物來講比較經濟，現已被廣泛應用于醫藥、農業等領域[5]。劉春龍等[6]研究發現，在一定范圍內的大豆黃酮和染料木素能夠促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，提高細胞抗氧化水平。陳靜[7]研究發現，12.5～50.0 μmol/L槲皮素能夠上調奶牛乳腺上皮細胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力。然而利用細胞培養的方法來研究苜蓿黃酮對乳腺上皮細胞的影響尚未見報道，因此，本試驗通過添加苜蓿黃酮來探究其對體外培養奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響，為推廣苜蓿黃酮在動物生產上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

奶牛乳腺上皮細胞由本試驗室通過組織塊培養法獲得；苜蓿黃酮由陜西綠清生物工程有限公司提供；DMEM/12培養基和胎牛血清購于Gibco公司；MTT和雙抗購于Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)購于Solarbio公司；RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；抗氧化指標試劑盒購于南京建成生物有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養 細胞培養從2014年10月開始，細胞培養方法參照Nayeli等[8]的奶牛乳腺上皮細胞培養方法。

1.2.2MTT法測定細胞增殖 以密度為0.8×104個/孔細胞接種到96孔板，分為5組，每組5個重復即對照組(基礎培養基+0 μg/mL)、試驗Ⅰ～Ⅳ組(基礎培養基中分別加25，50，75和100 μg/mL)，其中苜蓿黃酮用DMSO溶解，對照組和各試驗組中的DMSO含量為2‰，細胞培養到第3天和第5天分別在每孔中加入20 μL 0.5%MTT，再在培養箱中繼續培養4 h，然后去除培養液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2遍，每孔加入DMSO 150 μL 于搖床混勻10 min，最后在490 nm(酶標儀)下測定OD值。

1.2.3NO與LDH含量的測定 取密度為5×105個/孔細胞接種到12孔板，處理方法同MTT法，培養5 d后，根據所購買試劑盒中說明書進行測定各項指標，每組5個重復。

1.2.4抗氧化指標的測定 取密度為5×105個/孔細胞接種到12孔板，處理方法同MTT法，培養5 d后，根據所購買試劑盒中說明書測定各項指標，每組5個重復。

1.2.5細胞總RNA的提取和cDNA的合成 取密度為1×106個/孔細胞接種到6孔板，處理方法同MTT法，培養5 d后，根據RNA提取試劑盒說明書進行組織總RNA的提取，采用One Drop儀器進行總RNA的濃度和純度的測定。然后采用Takara反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。試驗在冰上進行，10 μL體系，反應條件為37℃，15 min;85℃，5 s;4℃。所得cDNA保存于-20℃待測。

1.2.6引物設計 根據Gene Bank中p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1基因序列，采用Primer 5.0軟件設計，引物由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.2.7Real Time-PCR 根據TaKaRa試劑盒說明書進行冰上配制反應液(表2)，后在羅氏Light Cycler?96 PCR儀上進行檢測。PCR反應條件為,第1步預變性：95℃ 30 s。第2步PCR反應：進行以下循環40次：95℃ 5 s，60℃ 20 s。第3步融解曲線分析：65℃ 15 s。

1.3數據處理

用Excel對試驗數據進行預處理，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0單因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比較，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。

2 結果與分析

2.1苜蓿黃酮對體外培養奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響

表2 RT-PCR反應液Table 2 The reaction liquid of real-time PCR

從表3可以看出，培養3 d的乳腺細胞的各組增殖水平差異不顯著，培養5 d的乳腺上皮細胞試驗Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組的增殖水平與對照組和試驗Ⅰ組差異極顯著(P<0.01)，但對照組與試驗Ⅰ組差異不顯著。說明高濃度的苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的增殖效果明顯，且試驗Ⅲ組效果最顯著。

表3 苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on the growth of dairy cow mammary epithelial cell

注：同行不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：The different capital letters mean highly significant differences (P<0.01) and the different lowercase letters mean significant differences (P<0.05)，the same below.

表4 苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞NO和LDH的影響Table 4 Effect of alfalfa flavonoids on NO and lactate dehydrogenase (LDH) of dairy cow mammary epithelial cell

從表4可以看出，體外培養奶牛乳腺上皮細胞上清中NO水平，試驗Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組明顯高于對照組與試驗Ⅰ組，且差異極顯著(P<0.01)。試驗Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅳ組的體外培養乳腺上皮細胞的LDH活性顯著低于對照組與試驗Ⅲ組，且差異極顯著(P<0.01)，但對照組與試驗Ⅲ組差異不顯著。乳腺上皮細胞上清中LDH活性降低說明添加苜蓿黃酮對保護細胞的完整性，防止細胞破裂死亡發揮了作用。

2.2苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化作用的影響

從表5可以看出，乳腺上皮細胞內試驗Ⅳ組的CAT水平明顯高于對照組、Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組(P<0.01)。SOD水平5組差異不顯著。試驗Ⅱ組與Ⅲ組的GSH-PX活性顯著高于對照組、試驗Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.01)，試驗Ⅱ組與試驗Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。MDA含量Ⅲ組明顯低于對照組、試驗Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅳ組，且對照組與試驗Ⅱ組差異不顯著。綜上所述，苜蓿黃酮通過提高CAT、GSH-PX的活性，來提高乳腺上皮細胞的抗氧化能力，且在用量為試驗Ⅱ組與試驗Ⅲ組時效果比較明顯。

表5 苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化作用的影響Table 5 Effect of alfalfa flavonoids on antioxidant status of dairy mammary epithelial cell

2.3基因p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1的RT-PCR結果

從表6可以看出，SOCS3基因的相對表達量分別是對照組的0.69，0.48，0.50，0.90倍，試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組顯著低于對照組(P<0.01)，且試驗Ⅱ組、Ⅲ組顯著低于試驗Ⅰ組、Ⅳ組，但試驗Ⅱ組與試驗Ⅳ組差異不顯著(P>0.01)，說明苜蓿黃酮降低了SOCS3基因的表達量。STAT1基因的相對表達量分別是對照組的0.79，0.34，0.83，0.89倍，顯著低于對照組(P<0.01)，其中試驗Ⅱ組含量顯著低于Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅳ組(P<0.01)，說明苜蓿黃酮降低了STAT1基因的表達量。p53、Caspase-3基因的相對表達量，試驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組顯著低于對照組與試驗Ⅰ組，說明苜蓿黃酮降低了p53、Caspase-3基因的表達量。

表6 奶牛乳腺上皮細胞p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1的表達Table 6 RT-PCR on p53, Caspase-3, SOCS3, STAT1 in dairy cow mammary epithelial cell

3 討論與結論

3.1苜蓿黃酮對體外培養奶牛乳腺上皮細胞功能與增殖的影響

研究表明苜蓿黃酮具有一定的雌激素作用[9]，苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的增殖作用機制可能是苜蓿黃酮中的活性成分作用于雌激素的受體，起到一定雌激素的作用，而雌激素具有促進乳腺管增生的作用，引起奶牛乳腺上皮細胞的增殖。本試驗表明培養3 d的乳腺細胞各組的增殖水平差異不顯著，培養5 d的乳腺上皮細胞試驗Ⅱ組、Ⅲ 組、Ⅳ 組的增殖水平與對照組和試驗Ⅰ組差異極顯著(P<0.01)。說明高濃度的苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的增殖效果明顯，且濃度在75 μg/mL時效果最顯著。穆瑩和江連洲[10]的研究表明大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的增殖具有明顯的作用。NO作為血管舒張因子增加血流量有顯著作用，乳腺上皮細胞分泌的NO進入乳腺血管中增加血流量，促進泌乳。隨著泌乳期的改變，乳腺中NO的含量會發生變化，其含量在泌乳前期與妊娠后期達到最大，證明NO對促進泌乳具有重要作用[11]。只有當細胞受損時LDH才能在細胞培養上清中檢出，所以細胞培養上清中LDH的濃度代表細胞的受損程度，本試驗中添加苜蓿黃酮培養的奶牛乳腺上皮細胞培養上清中試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組的LDH含量與對照組比較均有降低，說明苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞具有保護作用，對細胞增殖情況的檢測也進一步得到證實。本試驗中隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，其NO的含量隨之上升，說明苜蓿黃酮對奶牛的泌乳性能有積極的影響。但NO作為自由基其含量過高會對機體造成損害，因此需要控制細胞內NO的含量在正常范圍值以內。

3.2苜蓿黃酮對體外培養奶牛乳腺上皮細胞抗氧化能力的影響

機體在氧化反應過程中會產生自由基，自由基在機體內具有能量的傳遞等作用，但是自由基的活動失控及產量過多時就會對機體產生損害。這些自由基具有強氧化作用，會使機體在組織水平，細胞水平或分子水平產生損傷與破壞，最終導致疾病與衰老的發生[12]。CAT與GSH-PX都是機體內重要的抗氧化酶類，CAT能夠分解細胞中羥自由基對細胞的內環境產生保護作用[13]。GSH-PX含量的提高是動物機體抗氧化能力增強的標志之一；MDA是機體新陳代謝產生的自由基大量聚集引發細胞膜中不飽和脂肪酸過氧化的產物，細胞內MDA的水平可反映機體內脂質過氧化的程度，測定其濃度可以判斷細胞損傷的程度[14]。因此，通過測定機體CAT、GSH-PX的活力與MDA的含量，在一定程度上可以反映機體的抗氧化能力[15]。苜蓿黃酮中含有豐富的酚類物質，可與過氧化自由基結合，阻斷過氧化鏈式反應的進行，提高機體的抗氧化能力。本研究結果表明苜蓿黃酮通過提高奶牛乳腺上皮細胞內CAT、GSH-PX的活性，來提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力。試驗Ⅳ組可能因為苜蓿黃酮添加量過高而引起其他的影響，需要進一步的探究。李寶蘭等[16]通過研究小鼠灌胃苜蓿黃酮后發現在小鼠的肝臟和腎臟組織中,SOD活性明顯升高而MDA 的含量顯著降低。說明苜蓿黃酮可通過提高抗氧化酶的活性來增強機體抗氧化的能力。盧志勇等[17]研究發現，通過添加大豆異黃酮進行奶牛乳腺上皮細胞培養，可以顯著提升奶牛乳腺上皮細胞中CAT、SOD、GSH-PX的活性，顯著降低MDA的含量，起到增強細胞抗氧化能力的作用。近年研究表明，所有抗氧化劑都對體系有一定要求，大多數酚類抗氧化劑在高劑量下不但起不到抗氧化效果，反而有助于氧化。因此，對于苜蓿黃酮的適宜添加量還需進一步的研究。

3.3苜蓿黃酮對體外培養奶牛乳腺上皮細胞中p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1基因表達的影響

Boué等[18]在試驗中發現染料木素在質量濃度小于0.5 μg/L時，可以抑制乳腺癌細胞 MCF-7的增殖和生長。吳健全等[19]發現用5 μmol/L的染料木黃酮處理乳腺癌細胞后，癌細胞中血管內皮生長因子的 mRNA和蛋白表達水平逐漸降低。Cai等[20]研究發現在突變型 4～18 周齡的Apcmin鼠的飼糧中添加0.2%苜蓿素，與對照組相比，患腸癌的概率降低了33%；進一步的試驗發現苜蓿素對于抑制惡性胸腺癌細胞 MDA-MB-468 的生長具有重要作用。p53與STAT1基因在生物體內對于細胞周期與細胞凋亡有重要作用，且都能抑制細胞的癌變。STAT1 還有抗感染，調節免疫系統等作用。缺失STAT1的小鼠化學誘導的或者自發的腫瘤發生頻率要比野生型小鼠更高，并且抗腫瘤活性因子 IFNα 失活，由此STAT1被認定為腫瘤抑制蛋白[21]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應因子，Caspase-3誘導凋亡執行的機理為，它對全部或部分關鍵性蛋白酶進行裂解，從而使DNA片斷化，導致細胞凋亡。正常細胞中Caspase-3以無活性酶原的形式存在，由凋亡刺激因素作用以激活，激活的Caspase-3可以活化DNA修復酶、細胞骨架蛋白及核因子等，導致DNA裂解、細胞皺縮、凋亡小體形成和染色體濃縮等細胞形態的變化，最終引起細胞凋亡，對凋亡具有促進作用[22]。張曼和王桂敏[23]研究發現，菟絲子黃酮可以通過降低Caspase-3 蛋白的表達來抑制細胞凋亡的發生，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護的作用。細胞因子信號傳導抑制蛋白-3(SOCS-3)可以對多種細胞因子和激素(包括LIF，IL-11，生長激素，胰島素和瘦素)產生的信號傳導過程進行負調節，這些信號傳導過程的作用涉及啟動免疫反應，控制炎癥過程，調節生長發育以及淋巴細胞的分化等方面[24]。STAT1 可誘導凋亡蛋白的合成，Caspase-3前體可在體內或體外刺激的作用下形成凋亡蛋白，進而水解其他蛋白質。STAT1 還可以與p53蛋白作用，該蛋白參與調節細胞凋亡和細胞周期。平時機體由于缺氧、營養缺乏、DNA受損或者癌基因被激活使得原來處在低水平表達的p53蛋白，表達水平明顯提升[25]。本試驗RT-PCR結果表明，苜蓿黃酮通過下調Caspase-3、SOCS3、p53、STAT1的表達來起到阻止細胞癌變，抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應等作用。

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Proliferation stimulus and antioxidant effect of alfalfa flavonoids on dairy cow mammary epithelial cells culturedinvitro

SU Xiao-Shuang1**, ZHAN Jin-Shun1**, ZHAN Kang1, LIU Ming-Mei1,2, ZHAO Guo-Qi*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China； 2.JiangsuJointInstituteofTechnologyofProfessionofHuai’anBio-engineeringBranch,Huai’an223200，China

This experiment studied the proliferation stimulus and antioxidant effects of different concentrations of alfalfa flavonoids on cow mammary epithelial cells culturedinvitro.Media with five different concentrations of alfalfa flavonoids were prepared to culture dairy cow mammary epithelial cellsinvitro.Concentrations tested were:0 μg/mL (control group), 25 μg/mL (trial group Ⅰ), 50 μg/mL (trial group Ⅱ), 75 μg/mL (trial group Ⅲ), 100 μg/mL (trial group Ⅳ).The results showed:1) There was no significant difference in cell proliferation between the five concentrations during the first three days of cell culture, but the cell proliferation of trial groups Ⅱ-Ⅳ was significantly higher than for the control group and trial group Ⅰ (P<0.01) at day 5.2) The NO levels of trial groups Ⅱ-Ⅳ were significantly higher than the control group and trial group Ⅰ (P<0.01).Also, LDH activity of groups Ⅰ, Ⅱ, and Ⅳ was significantly lower than the control group and than test group Ⅲ (P<0.01), and the difference between the control group and test group Ⅲ was not significant.3) Intracellular CAT content of trial group Ⅳ was significantly higher than the other groups (P<0.01).The MAD content of group Ⅲ was significantly lower than the other groups (P<0.01).GSH-PX activity of groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than the other groups (P<0.01).In addition, there was no significant difference between the five groups in the cell SOD content.4) The relative expression levels ofp53,Caspase-3,SOCS3 andSTAT1 genes in groups Ⅱ and Ⅲ were significantly lower than control group (P<0.01).In summary, alfalfa flavonoids can promote the proliferation of bovine mammary epithelial cells culturedinvitro, improve cell antioxidant capacity and inhibit cellular apoptosis.The best effect occurred at a dosage of 75 μg/mL of alfalfa flavonoids.

alfalfa flavonoids; mammary epithelial cells; antioxidant; cell proliferation

10.11686/cyxb2015030

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-16；改回日期：2015-04-20

江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)，江蘇省高校研究生科研創新計劃項目(KYZZ_0367)和長三角地區生鮮乳質量安全追溯體系關鍵技術研究應用項目(14395810100)資助。

蘇效雙(1991-)，男，山東濰坊人，在讀碩士。E-mail:18765905923@163.com。占今舜(1985-)，男，江西玉山人，在讀博士。E-mail:zhanjs1023@sina.com。

蘇效雙, 占今舜, 詹康, 劉明美, 趙國琦.苜蓿黃酮對體外培養的奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響.草業學報, 2015, 24(12):139-145.

SU Xiao-Shuang, ZHAN Jin-Shun, ZHAN Kang, LIU Ming-Mei, ZHAO Guo-Qi.Proliferation stimulus and antioxidant effect of alfalfa flavonoids on dairy cow mammary epithelial cells culturedinvitro.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):139-145.

** 共同第一作者 These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author.E-mail:gqzhao@yzu.edu.cn