紫花苜蓿根頸芽發育成枝過程中葉元的發生模式研究

方強恩，張勃，師尚禮

(草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅農業大學草業學院，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

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紫花苜蓿根頸芽發育成枝過程中葉元的發生模式研究

方強恩，張勃，師尚禮*

(草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅農業大學草業學院，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

葉元由節、節間、葉器官以及葉腋下的側生分生組織組成，是植物莖枝生長發育的基本單位。本研究首次采用掃描電鏡技術，通過跟蹤觀察WL168紫花苜蓿根頸芽從萌發至孕蕾期頂端分生組織的微形態發育過程，初步探討了苜蓿葉元的發生發育規律。結果顯示，在苜蓿葉元發生過程中，復葉原基以向頂式的模式形成。腋芽原基和復葉原基均起源于頂端分生組織，但兩者并非同步生長，苜蓿葉元的發育過程由此表現出兩種模式：模式Ⅰ和模式Ⅱ。模式Ⅰ，復葉原基發育能力強，腋芽原基在側小葉原基形成后才出現，發育速度緩慢；模式Ⅱ，腋芽原基在托葉原基形成后便開始發生，相對模式Ⅰ發生時間提前，生長速度明顯快于復葉原基和生長錐。苜蓿根頸芽在返青出土前，其葉元以模式Ⅰ發生，出土后，轉變為模式Ⅱ。當地上葉元數增加到16～17時，腋芽原基發育為花序，小花原基開始出現。分析表明，根頸芽葉元的發生由模式I轉向模式Ⅱ是苜蓿營養生長向生殖生長轉變的標志，苜蓿根頸芽在返青出土前已完成了其營養器官的發生，出土后即轉入成花過渡期。

紫花苜蓿；根頸芽；葉元；原基

高等植物的生長發育是由頂端分生組織(shoot apical meristem，SAM)不斷產生重復單位，即葉元(phytomer)(又稱體節metamer)的過程[1-3]。每個葉元包括兩類亞單位：節點亞單位(nodal sub-unit)和節間亞單位(internodal sub-unit)，前者產生側生結構(包括葉片、腋芽)，后者形成莖結構(cauline structures)[4]。植物結構的這種重復發育模式，使得只需跟蹤觀察莖端分生組織的變化特征就能窺視其發育的全貌。在植物不同生長階段，雖然葉元中各組成部分(節間、葉和腋芽)的發育特點不盡相同[4]，但其“節-莖-葉連續體(node-stem-leaf contiuum)”結構不會變化，它是植物內在的自主性生理單元(autonomous physiological units)[5-6]。葉元所體現的這種拓撲學特征，為研究植物生長規律提供了新的視角和手段[7-10]。

目前，研究者已通過葉元研究對水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、白三葉(Trifoliumrepens)等栽培植物的生長發育規律進行了探索，并獲得了很多有價值的成果[8,12-14]。Fournier和Andrieu[15]研究表明，玉米莖稈的生長進程可劃分為4個階段，其中葉元長度變化和葉鞘的出現是階段1向階段2轉變的起始標志。Sylvie和Jean[7]應用葉元概念研究了水稻葉片和分蘗發生的同步性，結果發現主莖和蘗枝的葉片同步發生，腋芽能否發育為蘗芽取決于其空間拓撲位置以及主莖的發育階段。Kurihara等[11]研究發現，分析馬鈴薯(Solanumtuberosum)葉元的數量特征可以有效評價塊莖在不同生長階段的發育狀態，從而預測最終塊莖產量。

紫花苜蓿(Medicagosativa，文中簡稱苜蓿)是世界上種植規模最大、利用價值最高的優質牧草[16]。在其地下根頸部能持續形成大量根頸芽是苜蓿最重要的生長特性[17]，這種特性有利于苜蓿抗寒、抗旱和再生[18]。苜蓿的再生枝主要來自根頸芽[19-20]，單株根頸芽數量和發育成枝能力是決定苜蓿高產的關鍵因素[21]，但目前有關根頸芽發育成枝的規律仍不清楚。因此，研究根頸芽的發生發育機理對苜蓿育種和高產栽培均有重要意義。最新研究發現，擬南芥的莖端生長由營養階段向生殖階段轉變時其葉元特征發生了顯著變化，葉元中第一個節間的伸長是該植物轉向生殖生長的可靠標志[4,22]。據此推測，苜蓿根頸芽從萌發出土到發育成枝、成花過程中，其葉元的發生方式可能也存在著某種規律性變化。本研究選取WL168紫花苜蓿為材料，利用掃描電鏡跟蹤觀察了根頸芽發育成熟前后其芽端葉元的發生過程，試圖回答兩個問題：1)苜蓿葉元中葉片、腋芽的發生方式及其早期發育的時間次序是怎樣的；2)根頸芽從營養生長期向生殖生長期轉變時，葉元的發生方式是否發生了變化。

1 材料與方法

1.1材料

試驗材料為WL168(M.sativa‘WL168’)，種子購自北京正道生態科技有限公司。WL168是近年來由美國牧草資源公司(Forage Genetics International，FGI)培育出的高產、優質、多抗紫花苜蓿品種，秋眠級為2，抗寒級為1。該品種適應性強，在我國東北、內蒙古、新疆、西藏、甘肅和青海等地均可種植，是干旱、寒冷地區的首選品種。

1.2試驗地概況及種植管理

試驗在甘肅農業大學蘭州牧草試驗站進行，該地區屬溫帶半干旱大陸性氣候，四季分明、光照充足。海拔1517.3 m。年平均降雨量320 mm，年日照時數2474.4 h。田間試驗小區面積3 m×3 m，4次重復。2013年4月17日播種。播前結合整地施磷肥750 kg/hm2、氮磷復合肥375 kg/hm2。條播，播種行距30 cm，播量為15 kg/hm2。播種深度1.5～2.0 cm。田間管理包括間苗、中耕除草、適時灌溉。播種當年分別于7月5日、8月25日兩次刈割，每次留茬高度均為5 cm。

1.3試驗方法

取樣：自2014年3月5日開始取樣。每次挖取5株長勢一致的植株(根頸深為3 cm左右)，在距離根頸1 cm內的部位摘取長度相似的根頸芽15個，其中5個清洗后用2.5%戊二醛固定，用于掃描電鏡觀測。另10個用50%FAA固定，以備統計葉元數。芽出土前，每5 d取樣1次。芽出土后，按葉齡(地上完全展開的葉片數)取樣，直到13葉齡時(孕蕾期)結束。

葉元數的統計方法：取FAA固定后的芽置于解剖鏡下，用針和鑷子自下而上逐個剝下鱗葉(scale leaf，芽基部的鱗片狀葉)和幼葉(embryonic leaf，芽頂端沒有展開的早期葉)，直到芽端生長錐和兩個葉原基外露。鱗葉數和幼葉數之和便是葉元數。對于芽生長出土后發育而來的再生枝，分地下葉元數和地上葉元數兩部分分別統計。地下葉元數即地下鱗葉(scale)數，地上葉元數是地上莖部展開的葉片數(即葉齡數)和頂端幼葉數之和。

葉元發生過程的掃描電鏡觀察：取2.5%戊二醛固定2 h后的芽，切取頂端1～2 cm，放在鋪有濾紙的培養皿中，濾紙提前用PBS緩沖液浸濕，然后在解剖鏡下輕輕剝離幼葉直至芽露出生長錐，立即移入培養皿內用0.1 mmol/L的PBS沖洗3次，每次15 min；然后依次用30%，50%，70%，85%，95%和100%的乙醇脫水，每次15～20 min，其中100%乙醇置換2次；用1∶1的乙醇∶叔丁醇溶液置換30 min，再用100%叔丁醇置換2次，每次30 min；將置換后的芽置于4℃ 冰箱中預冷，然后放入VFD-21S冷凍干燥儀中進行干燥。待樣品干燥后，用碳導電膠粘到樣品臺上，在MSP-2S 型磁控離子濺射儀上噴金90 s。最后用日立S-3400N掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)進行觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1葉元的發生模式

發育成熟的苜蓿葉元由三出復葉、腋芽、節、節間組成，復葉包括托葉、一對側小葉和一個頂端小葉(圖1,圖2A)。苜蓿根頸芽萌發出土發育為枝條的過程，是頂端分生組織不斷重復形成葉元的過程(圖2B)，利用掃描電鏡技術可以完整地觀察到葉元的初始發育變化。從時間進程看，一個葉元的發育正好是伴隨復葉原基的形成而完成的(圖1)。依據早期葉原基、托葉原基、側小葉原基、腋芽原基和頂端小葉原基發生的時空次序，苜蓿葉元的發育形成過程可區分為5個階段(stages，S1～S5，圖1)。

本研究發現，在根頸芽出土前后的不同發育時期，葉元形成過程中5個階段的發生特點不盡相同，總體表現為兩種發育模式。

2.1.1模式Ⅰ 該模式下葉元的發生過程：在S1階段，芽頂端組織通過分化生長，首先在其一側邊緣出現凸起，形成條狀的早期葉原基(incipient leaf primordium，圖1A)，此時未見其他任何器官的分化。S2階段，葉原基向高、寬、厚3個方向生長，在其兩側分化出了托葉原基(stipule primordium，ST)。托葉原基半包圍頂端分生組織(圖1A)。S3階段，在托葉原基和葉原基之間形成了兩個側小葉原基(lateral leaflet primordium，LL，圖1B)。同時，在相對葉原基180°方向的位置，下一個葉元的早期葉原基已經開始顯現(圖1B，※)。S4階段，在葉原基近軸基部出現了腋芽原基(axillary bud primordium，AB，圖1C)。由于葉原基與生長錐同時在不斷進行頂端生長和邊緣生長，在該階段托葉和側小葉原基更加清晰易辨。S5階段，在葉原基遠軸面發育出了毛狀體(trichomes)(圖1D，箭頭)，頂端小葉原基(terminal leaflet primordium，TL)形成，發育增大的托葉和葉片原基明顯向內收攏，包裹住了腋芽原基和部分頂端分生組織。至此，一個葉元單位中的所有組成結構便全部發育形成。模式Ⅰ中葉元各組成的形成順序為：早期葉原基(節)→托葉原基→側小葉原基→腋芽原基→頂端小葉原基。

2.1.2模式Ⅱ 在模式Ⅱ中，S1階段的發育與模式Ⅰ相同(圖1E)。S2階段，1對托葉原基(ST)在早期葉原基兩側形成，此時在其基部已能隱約看到正在發生的腋芽原基(圖1E，※)。S3階段，腋芽原基(AB)形成(圖1F)，同時，在斜對葉原基(夾角小于180°)的位置，又開始了下一個葉元的發育(圖1F，※)。S4階段，在托葉原基和葉原基中間出現2個側葉原基(LL ) (圖1G)，該階段中腋芽原基發育速度很快，其生長高度已經與葉原基接近。S5階段，在葉原基頂端遠軸面可以看到正在形成的毛狀體(圖1H，箭頭)，頂端小葉原基(TL)發育形成。此時，腋芽原基繼續在偏離中心的位置快速生長，膨大鼓起，體積幾乎與生長錐相同，而且生長高度明顯超出葉片。至此，一個葉元單元全部發育完成。模式Ⅱ中葉元各組成的形成順序是：早期葉原基(節)→托葉原基→腋芽原基→側小葉原基→頂端小葉原基。

圖1 紫花苜蓿葉元的兩種形成模式

2.2根頸芽發育進程中葉元的變化特征

根頸芽在出土前，葉元以模式Ⅰ發生(圖2，表1)。新的葉元總是在前一葉元的相對位置(180°)有規律的出現。隨著葉元數的增加，芽不斷增長，臨出土時葉元數已增至(18.30±1.40)個(表1)。芽出土后，很快進入3葉齡期，在地下預先形成的葉元中有(10.20±1.10)個已露出地面，地下保留約(7.00±2.00)個葉元(表1)。與出土前相比，此時新葉元開始在偏離上一葉元正對面的位置發生，腋芽原基的發育速度明顯快于小葉原基，葉元發育開始表現出模式Ⅱ的發生特征(圖2D～I)。隨后，新葉元的發生愈加偏離前一葉元的中心軸，腋生分生組織發生速度不斷增加，體積變大(圖2E～I)。

10葉齡期，葉元形成速度增加，此時在芽頂端能同時看到3個正在發育的葉元(圖2G)。到11葉齡期，葉元形成速度進一步加快(表1)，芽端有5個葉元正在發育(圖2H)，地上葉元數已增加到(17.50±1.29)個(表1)。此時第16節的腋生分生組織已經發育為花序原基，并在其基部開始出現苞片和花原基(圖2H)。自11葉齡開始，花序原基快速分化，發育速度和生長體積均遠遠超過了頂端分生組織(圖2H～I)，從此，苜蓿開始縱向由下而上、橫向從外到內不斷分化出大量花原基(圖2I)。

圖2 紫花苜蓿根頸芽生長成枝過程中葉元的發育變化

表1 返青期紫花苜蓿根頸芽發育進程中葉元的變化特征Table 1 Phytomer developmental characteristics of crown bud of alfalfa during spring regrowth

3 討論

3.1苜蓿葉元發育過程中葉片與腋芽原基的發生

豆科植物復葉的發生方式具有多樣性。研究報道，百脈根(Lotusjaponicus)葉原基的發生順序是向基式(basipetal)的[23]。蒺藜苜蓿(M.truncatula)的復葉則以向頂式(acropetal)的模式發生[24]。豌豆(Pisumsativum)復葉結構特殊，葉頂端有卷須，在葉片早期發育過程中，小葉原基是向頂式發生的，但卷須卻是以向基式的模式發生[25]。本研究發現，紫花苜蓿的復葉發生模式為向頂式，與蒺藜苜蓿相同。復葉原基在發生過程中共出現了早期葉原基、托葉原基、側小葉原基和頂端小葉原基4個原基類型，這4個類型的原基沿縱軸方向自下而上依次形成。關于植物復葉中小葉沿縱軸發生方向的差異性，有一種解釋認為是由于復葉原基縱軸方向激活小葉原基細胞發生分化的區域不同而引起的。如果葉原基基部細胞分化活躍，新的小葉原基會由頂向基發育，相反，如果頂部細胞分化活躍，則新小葉原基由基向頂發育[26]。Ikeuchi等[27]通過對白屈菜(Chelidoniummajus)的研究發現，雖然白屈菜的葉原基表現出向基式的發育模式，但葉原基中活躍細胞在縱軸方向開始分化生長的位點是不固定的，該研究結果顯然與上述解釋不符。目前關于植物葉片發生方式的多樣性問題還沒有合理的解釋[28]，其形成機理有待進一步研究。

本研究發現，苜蓿葉元的形成過程表現出兩種模式：模式Ⅰ和模式Ⅱ。在這兩種模式中，腋芽原基的發生時間和發育能力并不同。模式Ⅰ，在托葉原基和側小葉原基形成期間還觀察不到腋芽原基。腋芽原基直到側小葉原基形成后才出現，且生長緩慢，之后被增大的葉原基包圍；模式Ⅱ中，腋芽原基在托葉原基形成期就已經發生，該原基發生后生長快速，很快高出了葉原基和生長錐(見圖1F-H)。Long和Barton[29]研究發現，在擬南芥早期生長階段，其基生葉腋部觀察不到腋生分生組織，腋生分生組織一直到莖生葉片形成之后才出現，這與本文研究結果相似。關于腋芽分生組織的發生原理有兩種解釋[30]：一是保留分生組織假說(reserve meristem hypothesis)，這一假說認為腋芽原基與其上的葉片原基一樣都起源于同一群頂端分生組織細胞，這些細胞從來沒有喪失它們的分生特性。另一種假說為從頭起始假說(initiation de novo hypothesis)，認為腋芽分生組織是在葉片形成后由其腋部的細胞重新起始形成的。據此判斷，苜蓿和擬南芥腋芽的發生特征似乎符合從頭起始假說。但有學者通過原位雜交技術研究發現，擬南芥在營養生長期，其基部葉腋中雖然觀察不到組織學上有明顯區別的腋芽分生組織，但在原基的近軸一側已有部分細胞表達LAS基因，LAS是腋芽分生組織起始所需要的基因，由此表明該位置早已具備形成腋芽分生組織的潛力，這一結果又支持了保留分生組織假說[31]。Leyser[32]分析認為，保留分生組織假說和從頭起始假說可能并非明顯不同的機制，只是其調控基因的表達和原基中細胞分化范圍不同而已。

3.2苜蓿葉元發生模式的意義

植物在不同發育時期，其葉元各組成(節間、葉片和腋芽)的生長發育會表現出相應的變異性[3]。這種變異性可以用來鑒別植物的發育階段[33-34]。Pouteau和Albertini[4]通過分析葉元的變化特征評價了擬南芥營養生長向生殖生長轉變的過程，結果發現，在營養生長期，葉元中僅見基生的葉片，觀察不到明顯的節間和腋枝。當發育轉向生殖生長階段時，葉元發生了兩次標志性變化：一次是節間首次伸長生長(bolting)，節部發育出腋生繁殖枝(paraclade)；另一次是從節部直接開出第一朵花。由于這兩次變化發生的時間和空間是不同的，因此擬南芥的生殖生長表現出兩個不同的發育區段：莖生葉區和花序區，在莖生葉區葉元側生結構包括莖生葉和發達的側生分枝，而花序區葉元的側生結構僅有小花。Leyser[32]簡練概括了擬南芥整個發育階段的變化特征，認為擬南芥葉片原基和腋芽原基都是由初生分生組織產生的原基分化而來，但在營養生長階段，原基主要用于產生葉片；成花過渡期，原基主要用于產生腋芽分生組織；到成花期，腋芽分生組織發育為小花。本研究發現，苜蓿葉元的發育變化特征與擬南芥相似。當葉元以模式Ⅰ發育時，葉原基發生早，且發育快速。腋芽原基在側小葉原基形成后才出現，發育緩慢，很快被增大的葉片原基包圍。顯然，該模式下分生組織細胞的分化主要傾向于產生葉原基，葉原基對腋芽和生長錐起到明顯的保護作用。當轉變到模式Ⅱ后，腋芽原基在托葉原基形成后便出現，與模式Ⅰ相比，發生時間提前，且生長速度明顯快于葉原基和生長錐。該時期葉器官的發育相對滯后，分生組織細胞的分化以腋芽發育為主。葉片由于發育遲緩，對芽端生長錐和腋芽原基的保護作用明顯減弱。兩個葉元間的相對著生位置也發生了變化(表1)。當地上葉元數增加到16～17后，腋芽分生組織發育為花序原基，苞片和小花原基也開始形成。根據Leyser[32]的觀點，在苜蓿根頸芽發育過程中，葉元的模式Ⅰ發育時期為營養器官生長期，模式Ⅱ發育時期為成花過渡期，葉元發生方式由模式Ⅰ轉向模式Ⅱ是苜蓿營養生長向生殖生長轉變的標志。當地上葉元數增加到16～17后，發育進入成花期。

苜蓿根頸芽發育成枝的能力決定單莖生物量的形成，是影響苜蓿高產的一個潛在指標[21]。本研究首次從葉元水平揭示了苜蓿根頸芽發育進程中生長階段的轉變過程和判斷方法，這為根頸芽發育成枝機理和苜蓿高產栽培技術研究提供了理論基礎。

3.3苜蓿根頸芽的預生長

大多數溫帶多年生草本植物會利用前一年或更早預發生的芽在當年形成更新枝[35-36]，不同植物再生芽的預發生時間是不同的。Meloche和Diggle[37]發現，薔薇科羽葉花屬植物Acomastylisrossii的葉和花序提前3年預先發生。高山植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)的葉與花序從預發生到成熟至少需要4年時間[38]。不同物種間芽的預先發育程度也存在差異。有些植物僅預先形成莖、葉等營養器官，也有植物會預先形成莖、葉以及花序[39-40]。目前關于草本植物芽預生長的研究主要集中在溫帶高山草原與北極凍原植物的生態適應性方面[38,41]，有關栽培作物芽預生長規律的研究鮮有報道。本文研究發現，苜蓿根頸芽的大多數葉節是在前一個生長季形成的。返青出土前根頸芽已經預先形成(18.30±1.40)個葉元。出土后，早期預先形成的(10.20±1.10)個葉元隨之露出地面，葉元的發生模式此時也由出土前的模式Ⅰ轉變為模式Ⅱ，當地上葉元數增加到(17.50±1.29)個時，腋芽分生組織發育為花序。根據上述研究結果分析，苜蓿根頸芽在返青出土前已經預先完成了營養器官的發生，出土后便立即向成花期過渡。Stubbendieck和Burzlaff[42]在對格蘭馬草(Boutelouagracilis)葉元發育的研究中發現，該植物分蘗芽從發生到開花平均發育13個葉元，其中前6個葉元是提前1年預發生的，后7個葉元在返青期形成并很快發育為生殖枝，這種預生長特性與本研究結果相似。Diggle[38]認為，芽的預生長特性有利于植物莖葉和繁殖結構在下一個生長季開始后迅速成熟。因此，根頸芽的預先發育為苜蓿返青期的快速生長和高產牧草的形成奠定了基礎。

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Development of phytomers produced by root crown shoots inMedicagosativa

FANG Qiang-En, ZHANG Bo, SHI Shang-Li*

KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,SinoU.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

The phytomer, consisting of a node, leaflike organ, internode, and lateral meristem in the axil of a leaf, is a basic structural unit of shoot growth and development.With scanning electron microscopy (SEM), the developmental characteristics of phytomers in alfalfa variety ‘WL168’ were observed throughout the developmental phases of the apical meristem in crown buds from sprouting to flowering.During the development of phytomers, the primordial compound leaf emerged in an acropetal pattern.Both the primordial axillary bud and compound leaf originated from the apical meristem, but they differed in the rhythm of development; phytomers showed two patterns of development.Pattern-I was featured by the faster development of primordial compound leaves than primordial axillary buds which appeared after the formation of lateral primordial leaves.For patternⅡ, primordial axillary buds grew faster than primordial compound leaves, initiating after the formation of primordial stipules.Before the crown bud emerged from the soil, the phytomer developed through pattern-Ⅰ, and immediately after emergence, through pattern-Ⅱ.When the number of aboveground phytomer reached 16-17, the axillary meristem became reproductive.It was concluded that the shift of phytomer development from pattern Ⅰ to pattern Ⅱ can be an indicator of the transition from vegetative to reproductive growth in alfalfa.

alfalfa； crown bud； phytomer； primordium

10.11686/cyxb2015253

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-05-14；改回日期：2015-06-26

國家現代牧草產業技術體系-栽培與草地管理(CARA-35)，農業部牧草種質資源保護與利用(NB2130135)和甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1228)資助。

方強恩(1980-)，男，甘肅天水人，講師，在讀博士。E-mail:fangqen@163.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:shishl@gsau.edu.cn

方強恩, 張勃, 師尚禮.紫花苜蓿根頸芽發育成枝過程中葉元的發生模式研究.草業學報, 2015, 24(12):146-154.

FANG Qiang-En，ZHANG Bo，SHI Shang-Li.Development of phytomers produced by root crown shoots inMedicagosativa.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):146-154.