維生素D在DSS誘導的實驗性腸炎中的作用研究

趙 晴,婁 巖,孫 燦,付 瑜,車千紅,孔 娟*

·論著·

維生素D在DSS誘導的實驗性腸炎中的作用研究

趙 晴1,婁 巖2,孫 燦1,付 瑜1,車千紅1,孔 娟1*

目的 探討維生素D在2.5% 硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的實驗性腸炎中的作用。方法 隨機抽取C57BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只分別為對照組和實驗組，將DSS加入飲用水中配成2.5%DSS溶液分別喂食，評估兩組癥狀評分及生存時間。另行體外實驗，應用5%的DSS溶液刺激Caco-2細胞單層，實驗組加入1,25(OH)2D3，對照組不予額外處理，測量兩組細胞跨膜電阻。結果 正常野生鼠對2.5% DSS誘導的實驗性腸炎可耐受，VDR敲除鼠出現嚴重腹瀉，直腸出血，體重顯著降低等，相對于對照組癥狀評分增高，生存時間縮短。對照組的細胞跨膜電阻在4 h內逐漸下降，而實驗組細胞的跨膜電位在初始階段有所下降，4 h后恢復正常。結論 維生素D在2.5% DSS誘導的實驗性腸炎中能夠起到保護作用。在體外試驗中,1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導的實驗性腸炎,為進一步研究維生素D及其信號系統的功能提供了理論依據。

維生素D;硫酸葡聚糖鈉;實驗性腸炎；Caco-2細胞

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，近年來的研究顯示，其能作為激素參與調節機體的多種生理功能[1]。維生素D是核受體家族的一員，通過與維生素D受體(VDR)結合而發揮調節下位基因的作用。維生素D受體(VDR)廣泛存在于各種組織和器官中，與活化的1，25(OH)維生素D結合，調節下游信號系統[2]。研究發現，維生素D具有極其重要的生理功能，除調節體內鈣磷平衡外[3]，還影響免疫、神經、生殖、內分泌、上皮及毛發生長等[4-5]。故有學者認為，維生素D是一種激素而不只是單純的維生素[6]，稱之為維生素D內分泌系統[7]。

炎癥性腸病(IBD)的發病機制尚未闡明，一般認為IBD是由遺傳、環境、微生物、免疫因子等因素的復雜的相互作用所致[8]。以往研究應用硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導小鼠腸炎模型，可見小鼠呈現不同程度的急性腸炎表現，包括體重增長緩慢、便血、腹瀉等，病理顯示小鼠結腸有不同程度的結腸粘膜腺體結構紊亂，單核細胞和多核細胞浸潤[9-10]即DSS誘導的實驗性腸炎。

既往的研究表明，維生素D缺乏會增加患炎癥性腸病的風險[11-12]。也曾有臨床病例分析提示,潰瘍性結腸炎患者機體內維生素D儲備降低，維生素D缺乏與疾病活動性相關[13]?？傊絹碓蕉嗟淖C據支持維生素D缺乏與炎癥性腸病之間存在病理性聯系。為了探索相關機制，本研究應用DSS誘導的急性實驗性腸炎模型來觀察維生素D對腸道損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機抽取C57BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只，分別為對照組和實驗組，2月齡，體重20～25 g，性別不限，室溫飼養，飼料為普通動物飼料。

1.2 試劑與材料 DSS(Wako Pure Chemical Industries Ltd.,日本和光純藥工業株式會社)，Caco-2細胞株(American Type Culture Collection,Rochville,MD,美國)，胎牛血清(Hyclone，美國);DMEM 高糖培養基(GIBCO，美國);Millicell 小室(Millipore，美國);Transwell 24 孔培養板(Corning，美國);Millicell ERS 電子伏特計(美國Millicell 公司);超凈工作臺、細胞培養箱(德國Heraeus公司)。

1.3 實驗性腸炎模型的建立 將DSS加入蒸餾水中配成2.5%DSS 溶液，分別給兩組小鼠喂食6 d，自第7天起喂食正常蒸餾水，自然死亡或至12 d后統一處死。

1.4 腸炎的評估 密切監測小鼠的體重及癥狀，包括腹瀉程度、直腸出血等。癥狀評分總分為6分，評分標準如下：①大便次數。0分：1～2次/d；1分：3～5次/d；2分：>5次/d。②肉眼血便。0分：無；1分：有。③直腸脫垂。0分：無；1分：有。

1.5 Caco-2單層細胞模型的建立 將Caco-2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、含5% CO2、相對濕度90% 的環境中。將Caco-2 細胞種植于Transwell 培養板上的Millicell 聚碳酸酯膜小室上(Pore sizes 0.4 μm)，細胞種植密度為 5.5×105個/mL。接種后隔日換液，1周后每日換液，培養至21 d，滿足跨膜電阻TEER>200 Ω*cm2。

1.6 細胞轉運實驗 將分化良好的Caco-2 細胞接種于六孔板上培養24 h,接種密度為1 × 107個/mL。用PBS將分離的細胞沖洗掉。余下的細胞單層分為實驗組和對照組，對照組繼續置于含1%胎牛血清的DMEM培養液中48 h，實驗組在培養液中加入1,25(OH)2D3，培養相同時間。應用5%的DSS溶液刺激兩組細胞單層10 min，用跨膜電阻儀分別于10、20、30、60、90、120、180、240 min測量兩組細胞單層跨膜電阻。

2 結果

2.1 兩組小鼠發生結腸炎的狀況分析 比較兩組小鼠的結腸炎臨床癥狀，發現VDR敲除鼠進展為更為嚴重的結腸炎，腹瀉次數明顯增多，多數可見肉眼血便，更有甚者發生了直腸脫垂。依照癥狀評分標準，評分越高代表結腸炎臨床癥狀越嚴重。在給予飲用DSS溶液的第2天和第6天，分別對兩組小鼠進行癥狀評分。圖1顯示，第2天兩組小鼠的癥狀評分較初始狀態升高，證明實驗性腸炎模型建立成功，而VDR敲除鼠的癥狀評分較正常野生對照組明顯升高。在第6天，對照組評分逐漸下降，而實驗組仍有上升。說明正常野生鼠對2.5% DSS溶液基本耐受，其腸道黏膜可在一定范圍內自行修復，腸道功能也可逐漸恢復，而VDR敲除鼠喪失了腸道修復的能力，隨著時間延長，其結腸炎臨床癥狀反而加重。

圖1 兩組小鼠癥狀評分比較

2.2 兩組小鼠的體重變化比較 如圖2所示，0 d為兩組小鼠的初始體重。在給予DSS溶液的第1天，兩組小鼠體重未見明顯改變，第2天～第6天，兩組小鼠開始出現較明顯的結腸炎癥狀，導致體重均有所下降，其中VDR敲除鼠體重下降更為明顯。第6天起，正常野生鼠的體重開始回升，結合圖1的癥狀評分，與該組小鼠已從實驗性腸炎中逐漸恢復有關。而后將DSS溶液更換為正常蒸餾水，對照組小鼠體重上升更為明顯，至第8天，正常野生鼠的體重已增長至初始體重的105%。實驗組盡管DSS溶液已撤除，更換為正常蒸餾水，仍未能阻止VDR敲除鼠體重持續下降的趨勢。

圖2 兩組小鼠體重比較

2.3 兩組小鼠的存活率比較 如圖3所示。在給予DSS溶液后的6 d內，對照組小鼠全部存活，而VDR敲除鼠隨著腸炎癥狀加重存活率逐漸下降，相應的死亡率上升。第7天起，更換DSS溶液為正常蒸餾水至第12 天，VDR敲除鼠并未因此恢復，呈現出更低的存活率，至實驗結束共12 d，80%的VDR敲除鼠死亡。對照組無一例死亡。

圖3 兩組小鼠存活率比較

2.4 兩組跨膜電阻比較 Caco-2細胞單層體外培養實驗中，以1,25(OH)2D3加入培養液中的細胞作為實驗組，未處理的細胞作為對照組，分別測量兩組細胞經5%DSS溶液浸潤后的跨膜電阻，結果見圖4。對照組的細胞跨膜電阻在4 h內逐漸下降，證明DSS溶液對Caco-2細胞單層造成了損害。而實驗組的細胞跨膜電阻初始階段有所下降，4 h后恢復正常。提示1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導的實驗性腸炎，在一定程度上起到保護和修復腸道粘膜屏障的作用。

3 討論

流行病學證據表明，維生素D缺乏與IBD風險增加之間存在相關性[11],DSS誘導的實驗性腸炎模型具有人類潰瘍性結腸炎潰瘍和腸道屏障功能喪失的臨床和病理特點。盡管DSS產生的確切作用尚不清楚，但DSS能夠引起腸道粘膜損傷，最終導致炎癥。為了制造維生素D缺乏的模型，本研究采用VDR敲除鼠。正常條件下VDR敲除鼠除了會出現一定程度的結腸粘膜細胞增生外[14]，并不會出現腸道功能異常。而在DSS誘導下，VDR敲除鼠腸道粘膜會出現大量潰瘍。既往有研究報道了VDR敲除鼠經DSS處理后結腸的初始免疫應答[15]，維生素D在抗感染的同時，調控抑菌肽的表達，既能維持腸道黏膜表層屏障的完整，又可修復腸黏膜通透性。近年來有關維生素D在免疫系統中的調節作用是研究熱點，維生素D可通過抑制細胞免疫及自身細胞毒性T細胞的激活，來調節免疫反應。因此，維生素D缺乏可危害黏膜屏障，導致黏膜損傷及產生IBD的風險加大[16]。維生素D在調節黏膜表面菌群、抑制腸腔細菌黏附、調整緊密連接蛋白、維持黏膜屏障完整性、抑制致病菌入侵及移位、調節免疫反應等IBD發病的環節均發揮著重要作用[17]。本研究顯示，野生鼠大部分對2.5% DSS耐受，癥狀評分較低，并隨著用正常蒸餾水代替DSS溶液，野生鼠逐漸恢復，癥狀評分進一步降低，體重從初期略有下降直至實驗結束后反而有所上升，實驗過程中存活率100%。VDR敲除鼠發生嚴重腹瀉、直腸出血、脫水、明顯體重降低，癥狀評分顯著增高，以至于12 d內大量死亡。結果表明，對于DSS誘導的粘膜損傷，VDR敲除鼠比正常鼠易感得多。

圖4 兩組跨膜電位比較

Caco-2細胞來源于人類結腸癌細胞，是目前藥物吸收的主要研究方法之一。Caco-2細胞單層模型是目前公認的理想的體外模型，Caco-2 細胞可在培養條件下，在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上生長、融合，并自發進行上皮樣分化和形成緊密聯結，分化出絨毛面(腸腔側)和基底面(腸壁側)，其形態學、標志酶的功能表達與小腸上皮細胞相似，因此該細胞模型成為預測藥物在人體小腸吸收以及藥物轉運機制研究的標準篩選工具，是體外考察藥物吸收、代謝等的一個經典模型[18-19]。細胞亞顯微結構研究表明，Caco-2細胞與人小腸上皮細胞在形態學上極為相似，具有相同的細胞極性和緊密連接[20]，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系。胞飲功能的檢測也表明，Caco-2細胞與人小腸上皮細胞類似，其結構和生化功能均接近于人體小腸上皮細胞屏障[21]。以上的特性可以恒定維持約20 d。因此可以在這段時間進行藥物的跨膜轉運實驗[22]。

曾有文獻推測在Caco-2細胞培養中，1,25(OH)2D3可通過增加連接蛋白表達提高由人腸道上皮細胞系單層形成的連接緊密性并保留在DSS存在下的緊密連接的結構完整性[8]。本實驗利用相同濃度的DSS溶液在相同條件和時間刺激Caco-2細胞單層，加入1,25(OH)2D3實驗組表現出細胞跨膜電阻輕度損傷后迅速恢復，而未加入1,25(OH)2D3的對照組表現出細胞跨膜電阻持續下降，由此證明兩組細胞跨膜電阻的差距來源于是否添加1,25(OH)2D3，推測1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導的實驗性腸炎。

綜上所述，本研究表明，當維生素D受體缺失時，小鼠會出現更加嚴重的結腸炎臨床癥狀，表現為體重下降、癥狀評分升高、死亡率上升；另一方面，添加了活性維生素D的細胞抵御DSS誘導的實驗性腸炎能力增強。由此可見，1,25(OH)2D3在腸道損傷的情況下，能夠起到保護腸道粘膜屏障的作用，為臨床上應用1,25(OH)2D3作為炎癥性腸病的一種輔助治療預防復發的有效措施提供了理論依據[23]。

[1] 張秀敏,李宇寧.慢性腎臟疾病患兒維生素D水平研究進展[J].國際兒科學雜志,2013,40(5):470-473.

[2] 李榕,樓煜清,顏波,等.維生素D受體基因多態性位點rs7975232與肺癌發病風險的相關性[J].實用醫學雜志,2013,8(10):1390-1392.

[3] 于靜,李衛國,李宇寧,等.維生素D和鈣劑治療營養性佝僂病療效的Meta分析[J].國際兒科學雜志,2014,41(5):548-554.

[4] 楊李娜,陳宜鋒.維生素D在骨骼病變外的應用研究進展[J].中國醫藥,2014,9(4):606-608.

[5] 陳建平,張春,江趙丹,等.1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖與凋亡的影響[J].實用醫學雜志,2014,30(3):342-345.

[6] 徐艷娜,顧劍華,金曉群.血清25-羥維生素D3及總免疫球蛋白E水平與嬰幼兒反復喘息的相關性研究[J].中國醫藥,2014,9(11):1582-1584.

[7] 趙晴，婁巖，李丹，等.維生素D受體對急性肝臟損傷保護作用的研究[J].實用藥物與臨床，2015，18(1)：24-27.

[8] Kong J,Zhang Z,Musch MW,et al.Novel role of the vitamin D receptor in maintaining the integrity of the intestinal mucosal barrier[J].AJP-Gastrointest Liver Physiol,2008,294(1):G208-G216.

[9] 韓英，張靜.N-乙酰半胱氨酸對硫酸葡聚糖鈉誘導的實驗性腸炎的預防及治療作用[J].中國醫藥導刊，2008，10(1)：130-133.

[10]何雙艷,李玨宏,李昌平,等.姜黃素對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠p38MAPK表達的影響[J].實用醫學雜志,2014,30(4):539-541.

[11]Lim WC,Hanauer SB,Li YC.Mechanisms of disease:vitamin D andinflammatory bowel disease[J].Nature Clin Pract Gastroenterol Hepatol，2005,2:308-315.

[12]藍德云,焦軍強,李平,等.維生素D受體基因Fok I位點單核苷酸多態性與潰瘍性結腸炎的關系[J].實用醫學雜志,2014,30(24):3955-3957.

[13]林艷，周然，林連捷，等.潰瘍性結腸炎患者血清25(OH)維生素D水平與疾病活動性的相關性[J].解剖科學進展，2014，20(2)：142-144，150.

[14]Kallay E,Pietschmann P,Toyokuni S,et al.Characterization of a vitamin Dreceptor knockout mouse as a model of colorectal hyperproliferation and DNA damage[J].Carcinogenesis，2001,22(9):1429-1435.

[15]Froicu M,Cantorna MT.Vitamin D and the vitamin D receptor arecritical for control of the innate immune response to colonic injury[J].BMC Immuno，2007，18:5.

[16]Guo XQ,Wang SJ,Zhang LW,et al.DNA methylation and loss of protein expression in esophageal squamous cellcarcinogenesis of high-risk area[J].Exp Clin Cancer Res,2007,26:587-594.

[17]樊星，翁謝川.炎癥性腸病病因研究進展[J].國際消化病雜志，2013，33(1)：6-8，16.

[18]Crivori P,Reinach B,Pezzetta D,et al.Computational models for identifying potential P-glycoprotein substrates and inhibitors[J].Mol Pharm,2006,3(1):33.

[19]Shirasaka Y,Kawasaki M,Sakane T,et al.Induction of human P-gly-coprotein in Caco-2 cells:development of a highly sensitive assay system for P-glycoprotein-mediated drug transport[J].Drug Metab Pharmacokinet,2006,21(5):414.

[20]Yamashita S,Furubayashi,Kataoka M,et al.Optimized conditions for prediction of intestinal drug permeability using Caco-2 cells[J].Eur J Pharm Sci,2000,10(3):195.

[21]余自成，高瑜，田薇薇，等.腸道轉運Caco-2細胞單層模型的建立及驗證評價[J].中國臨床藥學雜志，2012，21(4)：218-221.

[22]Fossati L,Dechaume R,Hardillier E,et al.Use of simulated intestinal fluid for Caco-2 permeability assay of lipophilic drugs [J].Int J Pharm,2008,360(1-2):148.

[23]麻繼臣，張曉嵐.維生素D與炎癥性腸病的研究進展[J].世界華人消化雜志,2008,16(23):2637-2643.

Effect of vitamin D on dextran sodium sulfate-induced experimental colitis

ZHAO Qing1,LOU Yan2,SUN Can1,FU Yu1,CHE Qian-hong1,KONG Juan1*

(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2 Computer Department,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To explore the effect of vitamin D on 2.5% DSS-induced experimental colitis.Methods Wild and vitamin D receptor (VDR) knockout C57BL/6 mice were divided into control group (n=10,wild) and experimental group (n=10,VDR knockout).The mice were fed with 2.5% DSS.The symptom score and life time was observed.Invitroexperiments: when Caco-2 monolayers were stimulated with 5% DSS,experimental group was added with 1,25(OH)2D3.The TEER of both groups was determined.Results The mice in control group were mostly resistant to 2.5% DSS-induced experimental colitis.There were a lot of symptoms such as severe diarrhea,rectal bleeding and marked body weight loss in the mice of experimental group.The symptom score of experimental group was higher than that of control group with shorter life time.The TEER gradually decreased within 4 h in control group,in experimental group,the TEER was moderately reduced at the beginning and fully recovered after 4 h.Conclusion Vitamin D can play a protective role on 2.5% DSS-induced experimental colitis,which provides a theoretical evidence for further study of vitamin D and the function of its signal system.

Vitamin D;DSS;Experimental colitis；Caco-2

2015-02-18

1.中國醫科大學附屬盛京醫院臨床營養科，沈陽 110004；2.中國醫科大學計算機教研室，沈陽 110122

國家自然科學基金(30971401、81170065)；遼寧省攀登學者計劃；遼寧省十百千計劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201506001

*通信作者