中藥制劑聯合美沙拉嗪對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用

余貽漢，楊建美，趙 莉，徐 沙，汪 毅

中藥制劑聯合美沙拉嗪對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用

余貽漢，楊建美，趙 莉，徐 沙，汪 毅*

目的 探討中藥制劑聯合美沙拉嗪對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用。方法 以C57BL/6小鼠為研究對象，采用DSS飲水法建立結腸炎模型，隨機分為4組：模型組、中藥制劑組、美沙拉嗪組、美沙拉嗪+中藥制劑組，分別于第4天給予生理鹽水、中藥制劑、美沙拉嗪、美沙拉嗪聯合中藥制劑灌胃。每日觀察各組小鼠精神狀態、大便性狀及體重變化；于第10天收集小鼠糞便行隱血測定，計算疾病活動指數(DAI)；斷頸處死各組小鼠，取結腸炎病變嚴重部位測定髓過氧化物酶活力(MPO)；取結腸炎病變嚴重部位做病理切片，行HE染色評價病變嚴重程度。結果 成功建立小鼠結腸炎模型，各治療組的DAI、MPO和組織學評分均較模型組明顯改善，其中聯合治療組較美沙拉嗪組明顯改善，差異有統計學意義。結論 復方中藥制劑聯合美沙拉嗪治療不僅能改善DSS誘導的小鼠結腸炎的癥狀評分，也能改善其病理評分。

中藥制劑；美沙拉嗪；結腸炎；DSS

0 引言

潰瘍性結腸炎(Ulcer colitis，UC)是一種腸道的非特異性炎癥性疾病，以反復發作的粘液膿血便為主要臨床表現。近年來，我國UC的發病率逐年上升[1]。目前對其發病機制的研究主要集中在感染因素、遺傳因素、環境因素及自身免疫因素4個方面[2]，但其具體發病機制尚不完全清楚。隨著醫學的發展，目前應用于潰瘍性結腸炎的治療藥物主要有：氨基水楊酸類、激素類、免疫抑制劑、生物制劑及中藥類[3]。Meta分析結果顯示，美沙拉嗪治療潰瘍性結腸炎在有效率、緩解率方面均優于安慰劑組[4]，但其治療周期長、停藥易復發、價格昂貴，患者難以長期堅持使用。近年研究表明，美沙拉嗪聯合中藥治療UC的療效較好[5-6]。本研究旨在研究美沙拉嗪(美沙拉嗪緩釋顆粒劑)聯合中藥制劑對小鼠UC模型的治療效果。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑 中藥制劑的組方包括：黃連5 g，白頭翁15 g，石榴皮15 g，五倍子10 g，總量45 g，置于1 000 mL燒杯中，加適量純化水浸泡30 min，煮沸后微沸30 min，濾出頭煎藥渣加適量水煮沸后微沸30 min，濾出二煎，合并兩次煎液靜置沉淀后加熱濃縮至100 mL，中藥藥液濃度為含生藥0.45 g/mL，藥原液裝瓶，高壓消毒后密封保存備用，中藥制劑灌胃劑量為0.2 mL/10 g體重，相當于9 mg/g體重。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium，DSS，美國Sigma公司)，美沙拉嗪(法國愛的發制藥集團，批號：H20100063)，髓過氧化物酶試劑盒(購自南京建成科技有限公司)。

1.2 實驗對象及模型建立 C57BL/6小鼠40只，購自武漢大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(鄂)2008-0004]，6～8周齡，18～22 g，雌雄不限，飼養于華中科技大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(鄂)2010-0057]，適應性喂養至少7 d。將小鼠隨機分為4組：模型組、中藥制劑組(中藥組)、美沙拉嗪組及美沙拉嗪+中藥制劑組(聯合組)，每組10只。參照文獻[7]制備小鼠結腸炎模型：給予所有小鼠含3%(w/v)DSS飲水10 d。

1.3 處理方法 自造模后第3天開始給予干預因素：中藥組給予中藥制劑0.2 mL/10 g體重灌胃；美沙拉嗪組給予美沙拉嗪7.4 mg/(kg·d)灌胃[8]；聯合組給予同劑量的美沙拉嗪和中藥制劑灌胃；模型組給予同劑量的生理鹽水灌胃。

1.4 觀察內容

1.4.1 疾病活動指數 每日觀察小鼠精神狀態，大便性狀及體重變化。于第10天記錄小鼠大便性狀，收集小鼠糞便行隱血測定，稱重計算小鼠體重變化百分數，按表1計算所有疾病活動指數(Disease activity index，DAI)。DAI=(體重下降指數+大便性狀指數+便血指數)÷3。

1.4.2 髓過氧化物酶活力 10 d后斷頸處死所有小鼠，剖取結腸組織，沖洗干凈后，稱取0.2 mg充分研磨后按說明書測定小鼠結腸髓過氧化物酶(MPO)活力。

表1 DAI評分

1.4.3 組織學評分 斷頸處死小鼠后，剖取結腸組織，取病變嚴重處用生理鹽水沖洗干凈，10%甲醛固定24 h后脫水、石蠟包埋，5 μm連續切片，蘇木素-伊紅染色。在顯微鏡下觀察，參照文獻[9]并稍做改動，制定組織學評分標準：①炎癥：無：0分，輕度：1分，中度：2度，重度：3分；②杯狀細胞：未見消失：0分，消失：1分；③病變深度：無：0分，粘膜下層：1分，肌層：2分，漿膜層：3分；④潰瘍：無：0分，糜爛：1分，潰瘍：2分；⑤隱窩膿腫：無：0分，有：1分。

2 結果

2.1 造模后DAI比較 小鼠在造模后第3～4天開始出現懶動、稀便、粘液血便，伴有體重下降。美沙拉嗪和聯合組小鼠的癥狀明顯改善，體重改變較小，聯合組的癥狀改善更明顯。于第10天計算4組小鼠的DAI，模型組小鼠的DAI高于其他3個治療組(P=0.00)。聯合組的DAI較美沙拉嗪治療組降低(P<0.01)。見表2。

2.2 各組髓過氧化物酶(MPO)活力比較 3個治療組的MPO活力均較模型組明顯改善(P=0.00)，聯合組比美沙拉嗪組改善更明顯(P<0.01)，差異有統計學意義，見表2。

2.3 組織學評分 結腸炎模型小鼠腸粘膜連續性消失，有大量炎性細胞浸潤，杯狀細胞消失，隱窩膿腫及潰瘍形成。治療組小鼠腸粘膜炎癥較輕，少量炎細胞浸潤，沒有明顯的隱窩膿腫(見圖1)。模型組小鼠的組織學評分為7.21±1.23，3個治療組評分較模型組均有所改善(F=19.75，P=0.00)。聯合組的組織學評分較美沙拉嗪組明顯減低(P<0.01)，差異有統計學意義，見表2。

表2 各組DAI、MPO、組織學評分對比

注：與模型組比較，*P<0.01；與美沙拉嗪組比較，#P<0.01

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種非特異性炎癥性疾病，西醫藥物治療的目的主要是誘導并維持緩解，但粘液血便反復發作使得該病的治療效果較差[10]。美沙拉嗪是治療潰瘍性結腸炎的經典藥物，其療效確切，不良反應少，服用方便[11-13]。但由于藥物依賴性、長期服用的耐藥性與不良反應及對患者的經濟壓力，限制了其在臨床的廣泛使用。

圖1 小鼠結腸HE染色(×200)

中醫學將潰瘍性結腸炎歸屬于“泄瀉”、“痢疾”、“腸癖”等范疇，定為濕熱內蘊型、氣滯血瘀型、脾胃虛弱型和陰血虧虛型4型，其治療多選擇清熱解毒、涼血止痢、活血化瘀、行氣止痛等組方，可口服，亦可保留灌腸[14]。本研究的中藥組方包括黃連、白頭翁、石榴皮、五倍子等。其中，黃連和白頭翁為千古名方“白頭翁湯”之君藥，為治泄痢之要藥和良藥。胡屹屹等[15-16]研究發現，白頭翁湯能明顯抑制LPS誘導內皮細胞分泌多種炎性因子，抑制凋亡基因轉錄，增強細胞能量代謝。方中黃連對革蘭陽性和陰性細菌、原蟲及各型流感病毒、真菌類等均有一定的抑制作用[17]。胡淑平等[18]研究發現，黃連素能顯著抑制小鼠巨噬細胞中TNF-α、IL-6及COX-2蛋白、mRNA的表達，減輕炎癥反應。石榴皮和五倍子酸澀收斂，入大腸經，能澀腸止泄痢，為治療久瀉久痢之常用藥，故該組方可以顯著改善結腸炎癥狀。

本研究結果表明，中藥制劑聯合美沙拉嗪能夠明顯改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的臨床癥狀，減輕結腸組織的充血出血、水腫、潰瘍和炎癥反應，推測與復方中藥抗炎、抑制炎癥反應及廣譜抗菌藥物等有關，提示復方中藥制劑聯合美沙拉嗪治療潰瘍性結腸炎可通過不同的機制來減輕病情，效果優于單用美沙拉嗪治療。

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Therapeutic effect of traditional Chinese medicine combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice

YU Yi-han,YANG Jian-mei,ZHAO Li,XU Sha,WANG Yi*

(Department of Digestive Internal Medicine,Hubei Xinhua Hospital,Wuhan 430015,China)

Objective To investigate the therapeutic effect of traditional Chinese medicine(TCM)combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice.Methods C57BL/6 mice were used as research subjects and were given water containing dextran sulfate sodium(DSS)to establish the model of colitis.They were randomly divided into four groups,mice in model group,TCM group,mesalazine group,TCM combined mesalazine group(combined group)were given normal saline,TCM,mesalazine,TCM combined with mesalazine by gavage administration from the fourth day respectively.The mental state,defecate traits and changes of body weight were observed every day.The disease activity index(DAI) was calculated.All the mice were sacrificed on the 10th day,and the inflammation degree of colon was assessed by HE dyeing as well as myeloperoxidase(MPO)activity assay.Results Colitis models of mice were established successfully.Compared with model group,DAI,MPO activity,microscopic inflammation score in treatment groups were improved significantly,and the levels in combined group were lower than those of mesalazine group.Conclusion The combined treatment of traditional Chinese medicine and mesalazine can improve not only the symptom score,but also the microscopic inflammation score in colitis mice induced by DSS.

Traditional Chinese medicine;Mesalazine;Colitis;Dextran sulfate sodium

2014-12-09

湖北省新華醫院消化內科，武漢 430015

湖北省衛生廳資助項目(XF2012-30)

10.14053/j.cnki.ppcr.201506002

*通信作者