去甲斑蝥素對非小細胞肺癌模型小鼠免疫功能的影響

付盈盈，李 林，章 激，張文靜，司應明*

去甲斑蝥素對非小細胞肺癌模型小鼠免疫功能的影響

付盈盈1，李 林1，章 激2，張文靜2，司應明1*

目的 研究去甲斑蝥素體內對非小細胞肺癌3LL模型小鼠免疫功能的調節作用。方法 常規培養3LL細胞，接種于ICR小鼠，將荷瘤小鼠隨機分為5組，陰性對照組，5-fu陽性對照組以及NCTD 3個劑量組，另設空白對照組。腹腔注射給藥2周后，取血檢測血常規以及血清TNF-α和IFN-γ含量；處死小鼠，分別剝取瘤塊、脾臟和胸腺，稱重并計算抑瘤率和臟器指數；取脾臟，制備脾淋巴細胞并測淋巴細胞增殖情況。結果 NCTD體內可抑制3LL模型小鼠腫瘤的生長；增加荷瘤小鼠白細胞總數；上調TNF-α和IFN-γ水平；降低脾臟指數和胸腺指數；促進T、B淋巴細胞增殖。結論 NCTD體內可調節非小細胞肺癌3LL模型小鼠的免疫功能。

去甲斑蝥素；3LL；小鼠；TNF-α；IFN-γ

0 引言

肺癌發生于支氣管粘膜上皮，屬于全球范圍內的高發性疾病，其發病率在男性惡性腫瘤中已占據首位[1]，女性的發病率也逐漸增高。現代醫學治療腫瘤疾病的技術已突飛猛進，但是即使使用先進的分子靶向治療，非小細胞肺癌患者的生存期也僅有所延長，而生活質量依然沒有得到明顯的改善[2]。中藥治療惡性腫瘤，通過扶正除邪，增強荷瘤機體的免疫功能，除了抑制腫瘤生長外，還能減輕放療、化療引起的胃腸道反應、骨髓抑制等不良反應，減輕患者痛苦，提高生活質量，抗腫瘤效果較好[3]。斑蝥素是從動物中提取的抗腫瘤中藥，廣泛應用于臨床，但因其有泌尿系不良反應和胃腸道反應而使其使用受到限制。為此我國又研制合成了斑蝥素衍生物，即去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，將原分子上1、2位的2個甲基去除得到，其抗腫瘤作用沒有改變，但不良反應明顯降低[4]。去甲斑蝥素在選擇性抑制腫瘤細胞生長的同時，可以保護正常細胞，已有研究證明，其對白細胞總數具有明顯的上調作用，還可調節機體的免疫功能等[5]，與放療、化療聯合使用，在輔助抗腫瘤的同時，還減輕了放、化療引起的骨髓抑制等不良反應，在腫瘤治療中有著很好的應用前景。本研究觀察NCTD體內對非小細胞肺癌3LL模型小鼠腫瘤的抑制作用，探討其對機體免疫功能的影響，考察其抗肺癌的作用機制，為NCTD治療非小細胞肺癌的臨床用藥提供理論依據。

1 材料

1.1 瘤株與動物 非小細胞肺癌系腫瘤3LL細胞由華中科技大學同濟藥學院饋贈。ICR小鼠，SPF級，體重18～20 g，雌雄兼用，購于襄陽醫學院動物實驗中心，合格證號：襄醫動字第2001001號。

1.2 試劑與儀器 RPMI 1640培養基(Gbico公司)；刀豆蛋白A和MTT(Sigma公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批號：1121030)；定量檢測TNF-α和IFN-γ酶聯免疫試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)；雅培血細胞分析儀(美國雅培-1700)；電子天平AY-120(日本島津)；ELx800型酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；分析天平(江蘇翔宇電子有限公司)。其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 按常規將非小細胞肺癌系腫瘤3LL細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養，生長至對數生長期時，收集腫瘤細胞，將濃度調整為1×107/mL的單細胞懸液用于實驗研究。

2.2 制造模型，分組及給藥 取ICR小鼠，將每只小鼠右前腋皮下注射“2.1”項中配好的3LL細胞懸液0.2 mL，待至瘤后隨機分為5組：荷瘤對照組、陽性對照組及NCTD高、中、低三個劑量組，每組10只，另設正常對照組。正常對照組和荷瘤對照組灌胃生理鹽水；陽性對照組以30 mg/kg劑量腹腔注射5-Fu；NCTD三個濃度組分別按15、30、60 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每周給藥4次，連續用藥2周，用藥期間觀察小鼠的活動量和一般狀況。

2.3 檢測小鼠血常規 停藥后次日，將各組小鼠摘眼球取血，EDTA抗凝，應用血細胞分析儀檢測血常規中白細胞(WBC)總數，以及淋巴細胞(LY)、中性粒細胞(NEUT)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EO)和嗜堿性粒細胞(BASO)百分比。

2.4 小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量測定 將“2.3”項所取的血液靜置后離心(3 000 r/min，10 min)，取血漿，用ELISA檢測試劑盒測定血清中TNF-α、IFN-γ的含量，按試劑盒說明書進行操作。在酶標測試儀上測定各樣本492 nm處吸光度值。分別繪制標準曲線，計算出血清中各細胞因子的含量。

2.5 檢測抑瘤率、脾臟指數和胸腺指數 取血后頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下將瘤組織、脾臟和胸腺分別剝離出，分析天平稱重。比較各給藥組與對照組瘤重、脾臟質量和胸腺質量的差異，并按照公式：抑瘤率(%)=[1-(給藥組平均瘤重/荷瘤對照組平均瘤重)]×100%；脾臟指數=脾臟質量(mg)/小鼠體重(g)；胸腺指數=胸腺質量(mg)/小鼠體重(g)，分別計算抑瘤率、脾臟指數和胸腺指數。

2.6 脾淋巴細胞增殖實驗 將“2.3”項中無菌條件下分離出的小鼠脾臟，按常規方法制成脾淋巴細胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞數為1×107/mL。并分別向脾細胞中加入ConA或LPS，接種于96孔培養板各孔中，另分別設只含有ConA或LPS的對照孔。將培養板置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的孵箱中培養48 h，采用MTT法檢測各孔活細胞總數的情況，酶標儀于570 nm處測定各孔的OD值。

3 結果

3.1 對荷瘤小鼠血常規的影響 結果顯示，模型組小鼠WBC總數明顯降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，各細胞百分比例失調。與模型組相比，NCTD三個劑量組WBC總數均明顯增多(P<0.05)，具有劑量依賴性，但仍少于正常對照組；NCTD各組NEUT、LY、MONO、EO和BASO絕對數(總數×比例)逐漸接近正常對照組。結果見表1。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.2 對荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的作用 實驗結果顯示，模型組小鼠的TNF-α和IFN-γ含量與對照組相比均明顯降低(P<0.01)；30 mg/kg的5-Fu腹腔注射給藥后顯著提高荷瘤小鼠TNF-α含量，降低IFN-γ含量，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；NCTD三個劑量均能提高荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 NCTD對荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的影響(n=10)

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 對荷瘤小鼠瘤質量的影響 實驗結果顯示，給藥2周后，30 mg/kg劑量的5-Fu腹腔注射給藥可明顯抑制荷瘤小鼠的腫瘤的生長，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.001)；NCTD三個劑量組(15、30、60 mg/kg)腹腔注射給藥對荷瘤小鼠瘤塊的生長皆有一定的抑制作用，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，且具有劑量依賴性。見表3。

表3 NCTD對荷瘤小鼠瘤質量的影響(n=10)

注：與模型組比較，##P<0.01

3.4 對荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響 實驗結果顯示，荷瘤小鼠脾臟指數及胸腺指數皆增加，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，5-Fu對脾臟指數及胸腺指數影響均較小(P>0.05)，而NCTD三個劑量均能降低荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數，但僅有高劑量NCTD組的脾臟指數與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 NCTD對荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響(n=10)

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.5 對荷瘤小鼠脾T、B淋巴細胞增殖的影響 本實驗OD值的大小可以反映小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖情況。實驗結果顯示，荷瘤小鼠T、B淋巴細胞的OD值明顯減少，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；5-Fu(30 mg/kg)腹腔注射給藥使T、B淋巴細胞的OD值更低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。NCTD體內給藥皆可顯著增加荷瘤小鼠的T、B淋巴細胞的OD值，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 NCTD對荷瘤小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

腫瘤的發生和發展過程是多種因素、多種機制共同作用的結果，機體的免疫功能是其中的一個因素。當機體免疫功能受到損害時，腫瘤細胞產生的免疫抑制因素以及免疫逃逸等作用均可導致腫瘤的發生和發展；而當機體發生腫瘤以后，機體的免疫系統又可通過多種方式和多種細胞因子作用于腫瘤細胞，并將其清除，從而達到抑制腫瘤生長的作用[6-7]。因此，通過提高機體的免疫功能可能達到抗腫瘤的效果，而機體的免疫功能又與多種機制有關。

外周白細胞為血液中重要的免疫細胞，可以幫助身體抵抗疾病以及外來物，在機體發生炎癥或其他疾病時，血液內的白細胞總數或細胞分類百分比會產生變化[8]。脾臟和胸腺都是機體重要的免疫器官，由脾臟產生的T淋巴細胞和B淋巴細胞分別介導的細胞免疫和體液免疫在機體抗腫瘤防御中共同發揮重要作用[9]。本研究結果顯示，以15、30、60 mg/kg的劑量分別給小鼠腹腔注射NCTD，在抑制肺癌模型小鼠腫瘤生長的同時，可顯著升高該小鼠的白細胞總數；同時調節荷瘤機體免疫器官的生長；還明顯促進由ConA和LPS分別誘導的肺癌模型小鼠T、B淋巴細胞增殖，從而證明NCTD對小鼠的免疫功能具有明顯的促進作用。

TNF-α是由免疫細胞分泌的細胞因子，對腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用，并能誘導腫瘤退行性變化。除了單核-巨噬細胞以外，其他如淋巴細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等也可以分泌TNF-α[10]。TNF-α能殺傷和消滅腫瘤細胞，限制腫瘤生長，最終導致腫瘤縮小、壞死而消失，對正常的機體和組織無毒性[11]，同時還能誘導和激活T、B淋巴細胞、增強NK細胞殺傷靶細胞促進吞噬功能等作用，因此，TNF-α的含量可直接反映機體的免疫功能。IFN-γ是活化的T細胞產生的細胞因子，具有多種潛能，在機體腫瘤發生、發展、移植排斥和腫瘤免疫逃逸中均有著重要作用[12-13]。IFN-γ對癌基因的表達具有抑制作用，能阻止或減慢腫瘤細胞的轉化過程；還可激活各種免疫細胞如巨噬細胞、NK細胞等，發揮直接殺傷癌細胞或間接抑制癌基因的作用；誘導腫瘤壞死因子，促進癌細胞對TNF受體、MHC I1類抗原的表達，故IFN-γ在臨床上用于抗腫瘤治療已非常廣泛[14]。本實驗結果顯示，小鼠患上腫瘤后TNF-α和IFN-γ含量明顯下降，而經NCTD處理后，荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量明顯提高，提示其可提高機體的免疫功能。

綜上所述，去甲斑蝥素小鼠體內能抑制非小細胞肺癌的生長，其抗腫瘤作用與提高機體的免疫功能有關[15]，包括增加白細胞總數，促進T、B淋巴細胞增殖、上調TNF-α和IFN-γ水平以及調節免疫器官的生長，該效應在一定范圍內呈現出劑量依賴性，隨著給藥劑量的增加而增強，其產生的抗腫瘤作用可能還有其他作用機制，尚需進一步研究。

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Effect of NCTD on immune function of mice with non-small cell lung cancer

FU Ying-ying1,LI Lin1,ZHANG Ji2,ZHANG Wen-jing2,SI Ying-ming1*

(1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangyang 441000,China;2.Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the immunomodulatory effect of NCTD on mice with 3LL.Methods Cells were cultivatedinvitro,ICR mice were inoculated the cells,then divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses of groups,and control group was set in addition.After 2-weeks treatment,venous blood of all mice were collected for immune cell level detection,and the tumors,spleen,as well as thymus were dissected to weight viscera index,and lymphocyte proliferation was tested.Results NCTD inhibited cell growthinvivo,increased WBC in tumor-bearing mice and increased TNF-α and IFN-γ levels.It reduced spleen index and thymus index,promoted T/B lymphocyte proliferation.Conclusion NCTD can regulate immune function in mice with non-small cell lung carcinoma 3LL.

NCTD;3LL;Mice;TNF-α;IFN-γ

2014-09-23

1.襄陽市中醫醫院，襄陽 441000；2.襄陽市中心醫院，襄陽 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201506009