維生素D受體對(duì)急性肝臟損傷保護(hù)作用的研究

趙 晴,婁 巖，李 丹,付 瑜,孫 燦,孔 娟*

維生素D受體對(duì)急性肝臟損傷保護(hù)作用的研究

趙 晴1,婁 巖2，李 丹3,付 瑜1,孫 燦1,孔 娟1*

目的 探討維生素D受體在內(nèi)毒素感染時(shí)對(duì)肝臟的保護(hù)作用。方法 隨機(jī)抽取C57 BL/6源性的野生小鼠10只和維生素D受體(VDR)敲除小鼠10只，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組LPS 15 mg/kg腹腔注射。應(yīng)用免疫組化及免疫熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR法等方法測(cè)定小鼠血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量、細(xì)胞因子及進(jìn)行PAI-1在肝臟組織中的定量分析。結(jié)果 注射LPS后，VDR敲除鼠肝臟中的巨噬細(xì)胞陽(yáng)性染色明顯多于對(duì)照組。VDR敲除組血漿AST水平明顯高于對(duì)照組。在基因敲除鼠肝臟中傷害性細(xì)胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明顯升高，而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯降低。PAI-1在VDR敲除鼠的肝臟中表達(dá)明顯增多。結(jié)論 VDR在內(nèi)毒素對(duì)肝臟損傷時(shí)能夠起到保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究維生素D及其信號(hào)系統(tǒng)的功能提供了理論依據(jù)。

維生素D；內(nèi)毒素；細(xì)胞因子；纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)

0 引言

維生素D是核受體家族的一員，通過(guò)與維生素D受體(VDR)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用[1]。VDR廣泛存在于各種組織和器官中，與活化的1,25(OH)維生素D結(jié)合，調(diào)節(jié)下游信號(hào)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，VitD具有廣泛的生理功能，除調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡外，近十幾年研究發(fā)現(xiàn)，維生素D通過(guò)其受體不僅調(diào)控脂肪細(xì)胞的發(fā)生[2]、脂代謝[3]、糖代謝[4]、免疫系統(tǒng)[5]，還通過(guò)調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)對(duì)心血管[6]、腎、腦以及動(dòng)物的行為等功能進(jìn)行調(diào)控，并影響神經(jīng)、生殖、內(nèi)分泌、上皮及毛發(fā)生長(zhǎng)等，故有學(xué)者認(rèn)為維生素D是一種激素而不是維生素，稱(chēng)之為VitD內(nèi)分泌系統(tǒng)。1,25(OH)維生素D3通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用，可以幫助免疫反應(yīng)的啟動(dòng)[7]。維生素D缺乏已被證實(shí)與修復(fù)免疫反應(yīng)有關(guān)，能降低白細(xì)胞的趨化作用和增加感染機(jī)會(huì)。

本研究應(yīng)用VDR敲除鼠和野生鼠的比較，探討維生素D在內(nèi)毒素對(duì)肝臟損傷時(shí)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究維生素D及其信號(hào)系統(tǒng)的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理方法 C57 BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只，2月齡，體重20～25 g，性別不限，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動(dòng)物飼料，自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各10只，對(duì)照組用同容積生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組用LPS 15 mg/kg腹腔注射。

1.2 免疫組化及免疫熒光法 肝臟組織用配制的10%福爾馬林(pH=7.2)固定、石蠟包埋，切片(4 μm/片);常規(guī)復(fù)水后，孵育一抗過(guò)夜;沖洗后孵育二抗室溫1 h,DAB染色，或直接室溫孵育熒光二抗1 h;脫水封片;用熒光顯微鏡進(jìn)行顯微照相。特異性抗巨噬細(xì)胞抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，貨號(hào)：MAC387。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定小鼠肝臟中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 將小鼠組織提取后，用TRizol法按照試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用美國(guó)Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。細(xì)胞因子的引物設(shè)計(jì)使用Primer 3.0設(shè)計(jì)合成特異性引物mB2M-2，atttcaatgtgaggcgggtggaac，mB2M-1，accggcctgtatgctatccagaaa，mIL1b-1，ccaaaagatgaaggggtgctgct，mIL1b-2，acagaggatgggctcttctt，mTNFa-1，cagaccctcacactcagatca，mTNFa-2，aacctgggagtagacaaggt，mIL12p35-1，gtgaagacggccagagaaaa，mIL12p35-2，agctccctcttgttgtggaa，mTrpc6-1，cctccctaatgaaaccagca，mTrpc6-2，gattgccagcattccaaagt，IL-18P1，aagcttcagaacacaatacataagcc，IL-18P2，gcaggcagcacaccacagg，IL10-1，ataatgcacccacttccca，IL-2，gggcatcacttctaccaggt，IL6-1，cctctggtcttctggagtacc，IL6-2，actccttctgtgactccagc。

1.4 Northern法檢測(cè)PAI-1基因的表達(dá) 用PCR法克隆一段cDNA片段,克隆進(jìn)入PSK質(zhì)粒中,經(jīng)常規(guī)擴(kuò)增后,雙內(nèi)切酶法產(chǎn)生PAI-1探針,凝膠電泳mRNA后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上,用P32標(biāo)記探針雜交轉(zhuǎn)印到X光片上，表達(dá)的數(shù)值用Image J.軟件分析。

1.5 血漿AST含量測(cè)定 經(jīng)心臟取血，抗凝離心后取上清，檢測(cè)血漿中AST含量，用Sigma公司試劑盒貨號(hào)Catalog Number MAK055，按說(shuō)明操作。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法結(jié)果 經(jīng)內(nèi)毒素15 mg/kg腹腔注射6 h后的野生鼠和VDR敲除鼠帶有巨噬細(xì)胞特異性抗moma抗體的肝臟切片的免疫染色顯示，在VDR敲除鼠肝臟中的巨噬細(xì)胞陽(yáng)性染色明顯多于對(duì)照組，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，內(nèi)毒素注射6 h后，VDR敲除鼠肝臟中開(kāi)始出現(xiàn)巨噬細(xì)胞增多，肝細(xì)胞損傷逐漸顯現(xiàn)。

圖1 免疫組化法結(jié)果

2.2 血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶含量測(cè)定 兩組小鼠接受LPS 15 mg/kg腹腔注射后18 h，野生型對(duì)照組和注射組相比，血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而注射LPS的VDR敲除組血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表明維生素D受體敲除后，LPS嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

圖2 血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量測(cè)定

2.3 細(xì)胞因子水平的變化 經(jīng)內(nèi)毒素腹腔注射18 h后，野生型鼠和基因敲除鼠肝臟組織中細(xì)胞因子的變化可見(jiàn)，在基因敲除鼠肝臟中傷害性細(xì)胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明顯升高，而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯降低，見(jiàn)圖3a、圖3b。肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞因子的增多代表肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。

2.4 PAI-1檢測(cè) 應(yīng)用Northern試驗(yàn)方法檢測(cè)PAI-1在肝臟經(jīng)LPS處理后8 h和16 h的表達(dá)，并用Image j.軟件定量，可見(jiàn)在注射LPS 8 h以后,VDR敲除鼠的表達(dá)增加,16 h表達(dá)仍然高于野生鼠。PAI-1的升高標(biāo)志著肝細(xì)胞凝血功能受損，進(jìn)一步證明內(nèi)毒素處理后的肝臟在VDR敲除鼠中受損嚴(yán)重。見(jiàn)圖4a、圖4b。

圖3a 內(nèi)毒素腹腔注射18 h后，野生型鼠和基因敲除鼠肝臟組織中細(xì)胞因子比較

圖3b 內(nèi)毒素注射6 h和18 h后，野生鼠和維生素D受體(VDR)敲除鼠肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞因子比較

3 討論

研究表明，內(nèi)毒素可損傷肝細(xì)胞膜，干擾肝細(xì)胞線粒體能量代謝過(guò)程[8-9]，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[10]。內(nèi)毒素可能主要通過(guò)免疫細(xì)胞-炎性介質(zhì)介導(dǎo)肝組織損傷。在體內(nèi)內(nèi)毒素首先激活Kupffer細(xì)胞，最終激活Kupffer細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，刺激細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)的合成與釋放，包括TNF-α、白介素、白三烯B4和補(bǔ)體C5，趨化循環(huán)中的中性粒細(xì)胞[11]。

圖4a PAI-1在肝臟經(jīng)LPS處理后8 h和16 h的定量

圖4b Northern PAI-1表達(dá)法的定量數(shù)值

這些被激活的中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用破壞肝細(xì)胞，釋放谷丙轉(zhuǎn)氨酶。

本研究結(jié)果表明，在內(nèi)毒素行腹腔注射6 h后，用巨噬細(xì)胞特異性抗體染色的巨噬細(xì)胞數(shù)量在VDR敲除鼠的肝臟中明顯增多(圖1)，這些增多的巨噬細(xì)胞可能由于LPS的趨化作用來(lái)自于血液循環(huán)中的單核細(xì)胞，也可能是局部肝臟中的Kupffer 細(xì)胞，因?yàn)長(zhǎng)PS腹腔注射后，經(jīng)腹腔中的腸系膜、大小網(wǎng)膜吸收入血進(jìn)入腸系膜靜脈，到達(dá)肝臟，首先對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用(圖2)。正如圖2中所示，在野生型鼠體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量在注射15 mg/kg LPS后沒(méi)有明顯升高，而VDR敲除鼠體內(nèi)AST的含量有將近10倍的增加，表明此劑量還沒(méi)有達(dá)到使野生型鼠肝臟受損的劑量，而缺乏VDR鼠的肝臟在極低的劑量下，肝細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞，谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，血中含量明顯升高，說(shuō)明有保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷的作用。IL-10 為體內(nèi)重要的抗炎性細(xì)胞因子，通過(guò)抑制Th1細(xì)胞的增殖和IL-2、IFN、白三烯等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制Th1型免疫應(yīng)答，降低患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)Treg的增殖和活化，從而有利于誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)外來(lái)病原的耐受。IL-6是一種由巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的多能單鏈黏蛋白細(xì)胞因子，在正常情況下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與炎癥反應(yīng)和在抗感染防御中起重要作用，而在病理狀態(tài)下，過(guò)度的升高可造成機(jī)體的病理性損傷。IL-18 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有多種調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞Th1 細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌，又能促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖和Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)TNF-α、NO、GH-CSF等炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生。同時(shí)該因子為一種最為強(qiáng)烈的TNF-α誘導(dǎo)因子，而TNF-α又通過(guò)正反饋通路刺激單核-巨噬細(xì)胞大量分泌IL-18，加速炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生，造成細(xì)胞免疫介導(dǎo)的組織炎癥性損傷[12]。大量LPS入血雖然可產(chǎn)生直接的毒性作用,但大部分有害作用是由于Mφ受LPS刺激后釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),本研究結(jié)果表明，維生素D敲除鼠肝臟中的傷害性細(xì)胞因子明顯高于野生型,而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯低于野生型。研究表明，肝臟組織中的細(xì)胞因子絕大多數(shù)由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。如果前幾種細(xì)胞因子分泌過(guò)多，在肝臟局部會(huì)產(chǎn)生破壞肝組織細(xì)胞的作用。PAI-1是生理上抑制纖溶酶原激活的抑制劑，是體內(nèi)最重要的纖溶活性調(diào)節(jié)因子，與多種血栓性和出血性疾病密切相關(guān)[13]。本研究中PAI-1在維生素D敲除鼠肝組織中表達(dá)增加。從圖4的結(jié)果看來(lái)，在內(nèi)毒素行腹腔注射8 h后，維生素D敲除鼠肝臟內(nèi)PAI-1的表達(dá)明顯高于野生鼠，16 h PAI-1在維生素D敲除鼠肝臟中的表達(dá)仍然明顯增多。表明PAI-1可能參與了LPS對(duì)肝臟的損傷作用。PAI-1在肝臟組織中表達(dá)的升高進(jìn)一步標(biāo)志著維生素D敲除鼠肝臟細(xì)胞受損的數(shù)目增多,從另一方面證明維生素D受體及其信號(hào)系統(tǒng)有保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷的作用。本研究應(yīng)用LPS經(jīng)腹腔注射后,研究肝臟中細(xì)胞因子和PAI-1表達(dá)在維生素D受體敲除鼠和野生鼠體中的變化，因野生鼠中維生素D受體健全，肝細(xì)胞受損輕微，而維生素D受體敲除鼠在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出肝酶升高，炎癥性細(xì)胞因子增多，凝血受損，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，表明兩者差異在維生素D受體上，證明了維生素D受體在內(nèi)毒素對(duì)肝臟損傷時(shí)的重要保護(hù)作用，從而進(jìn)一步證明了維生素D受體及其信號(hào)系統(tǒng)在傷害性刺激時(shí)具有保護(hù)肝功能的作用。

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Protective effect of Vitamin D receptor on acute hepatic injury

ZHAO Qing1,LOU Yan2,LI Dan3,FU Yu1,SUN Can1,KONG Juan1*

(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.Department of Computer,China Medical University,Shenyang 110013,China;3.Physical Examination Center,463 Hospital of Chinese PLA,Shenyang 110042,China)

Objective To explore the protective effect of Vitamin D receptor on hepatic injury induced by LPS.Methods The C57 BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group from 10 wild and 10 Vitamin D receptor(VDR)knockout mice respectively.LPS 15 mg/kg i.p.was injected into experimental group.Plasma AST of mice,the change of cytokines and PAI-1 quantity in liver tissue were determined by immunofluorescence,real-time PCR methods.Results Marked accumulation of macrophages were more in the liver of VDR knockout mice after LPS-treated than those in control group.Plasma AST in VDR knockout mice was significantly higher than that in control group.Nocuous cytokines IL-2,IL-18,IL-12,IFN-γ were significantly higher,and protective cytokine IL-10 was significantly lower in the liver of VDR knockout mice than those in control group.PAI-1 was significantly higher in the liver of VDR knockout mice.Conclusion Vitamin D receptor can play a protective role on hepatic injury induced by LPS,which provides a theoretical evidence for further study of Vitamin D and the function of its signal function.

Vitamin D;LPS;Cytokines;PAI-1

2014-09-12

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，沈陽(yáng) 110004；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)計(jì)算機(jī)教研室，沈陽(yáng) 110013；3.沈陽(yáng)市軍區(qū)463醫(yī)院體檢科，沈陽(yáng) 110042

國(guó)家自然科學(xué)基金(30971401、81170065)；遼寧省攀登學(xué)者計(jì)劃；遼寧省十百千計(jì)劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201501006

*通信作者