雷公藤內酯醇對糖尿病腎病大鼠腎內Glut-1、Glut-4表達的影響

尤麗菊，郭 輝，李宜川

雷公藤內酯醇對糖尿病腎病大鼠腎內Glut-1、Glut-4表達的影響

尤麗菊，郭 輝，李宜川

目的 探討雷公藤內酯醇對糖尿病腎病大鼠腎內Glut-1、Glut-4表達的影響。方法 將45只大鼠按體重隨機分為正常對照組(C組，13只)和糖尿病模型組(32只)。模型組腹腔注射鏈脲菌素(STZ) 52 mg/kg，1次/d，連續5 d；正常對照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。完成STZ 注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖，并同時測尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入糖尿病觀察對象。將造模成功的28只雄性大鼠，按體重、空腹血糖隨機分為DM模型組對照(DM組，14只)、雷公藤內酯醇組(TP組，14只)。結果 DM組、TP組第4、第8周的24 h尿mALB定量較C組明顯增加(P<0.01)，且DM組第8周高于第4周(P<0.01)，TP組第8周較第4周明顯降低(P<0.01)。DM組系膜細胞及上皮細胞Glut-1的表達較正常對照組均明顯增加(P<0.05)，Glut-4的表達均有所減少(P<0.05)。與DM組比較，TP組系膜細胞及上皮細胞Glut-1的表達降低(P<0.01)；Glut-4在系膜細胞的表達升高(P<0.05)，在上皮細胞的表達變化不明顯(P>0.05)。結論 雷公藤內酯醇能明顯降低糖尿病腎病大鼠腎小球系膜細胞及上皮細胞內的Glut-1含量，增高Glut-4在腎小球系膜細胞的表達。

雷公藤內酯醇；糖尿病腎病；大鼠；Glut-1；Glut-4

0 引言

雷公藤內酯醇(Triptolide，TP)又名雷公藤甲素，是從衛矛科植物雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.f)中分離提取得到的環氧化二萜內酯化合物，難溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物學活性[1]，早已用于糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)的治療[2]。測定24 h尿微量白蛋白(mALB)是公認的診斷糖尿病(Diabetes mellitus，DM)早期腎病的標準方法[3]。葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter，Glut)是調控細胞內糖攝入及糖代謝的第一道關卡，在介導糖尿病組織損傷中起重要作用[4]。其中葡萄糖轉運蛋白-1(Glut-1)是哺乳動物細胞糖跨膜轉運的主要載體，能促進葡萄糖向細胞內擴散及代謝[5]。Glut-1在腎小球系膜細胞和腎小球上皮細胞的表達已經得到了確認[6-7]。Glut-4主要分布于脂肪細胞和肌肉細胞[8]，即胰島素敏感性細胞，這些細胞在胰島素刺激下葡萄糖攝入迅速升高，Glut-4在腎血管、腎小球與腎小管也有表達[9-10]。本實驗主要觀察TP對糖尿病腎病大鼠腎內Glut-1、Glut-4表達的影響，為TP對糖尿病腎病的預防、治療提供實驗依據。

1 主要儀器和試劑

激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad Radinace 2100)、圖像分析儀(Media Cybernetics公司)、快速恒溫冰凍切片機(YD1508浙江金華益迪醫療設備廠)、血糖儀(羅氏公司)、全自動生化分析儀(日立7600型)、尿mALB試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)、鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，Sigma公司)、TP(上海融合有限公司)，Glut-1、Glut-4多克隆抗體，即用型SABC試劑盒，FITC標記二抗等(武漢博士德生物工程公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物與分組 SD大鼠45只，體重160～180 g，雄性，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2011-0007。將45只雄性大鼠按體重隨機分為正常對照組(C組，13只)和糖尿病模型組(32只)。造模前正常飼養1周，然后禁食12 h。糖尿病模型組腹腔注射STZ 52 mg/kg (臨用前用 0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解，pH 4.2)，1次/d，連續5 d。正常對照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。完成STZ注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖并同時測尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入DM觀察對象[11]。將造模成功的28只(造模過程中死亡4只，死亡原因可能是STZ的毒性作用)雄性大鼠，按體重、空腹血糖隨機分為模型對照組(DM組，14只)、雷公藤內酯醇組(TP組，14只)。

2.2 給藥方法 雷公藤內酯醇組給予TP混懸液(用少量吐溫-80溶解，再加入滅菌生理鹽水稀釋至所需濃度)1.8 g/kg灌胃，C組和DM組灌服等體積飲用水，連續給藥8周，每日上午1次。實驗期間大鼠自由飲水、飲食(DM組、TP組明顯比C組多飲多食多尿。DM組實驗中期死亡1只，原因可能是肺部感染；TP組實驗后期有1只死于腹瀉；其余動物精神活動均正常)，不使用胰島素及其他降糖藥物。

2.3 生化標本收集 分別于灌胃后第4周、第8周末采用不銹鋼代謝籠收集大鼠24 h尿標本，收集時預先將大鼠放入洗凈的代謝籠中，收集尿液期間大鼠禁食，自由飲水，盡量減少聲、光等對動物的刺激。記錄尿液總量后取10 mL，5 000 r/min離心5 min，去除沉渣，用免疫透射比濁法測24 h尿mALB。

2.4 標本制備 實驗第8周末，各組大鼠用電子天平稱重后，100 mL/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，約5 min后，剪開大鼠腹腔，10 mL注射器心臟取血，盡量取盡全血，迅速取出雙腎，腎臟經4 ℃預冷的生理鹽水灌洗，至整個腎臟顏色變蒼白后游離、去除包膜，稱重，取右腎按冠狀位縱行剖開，取腎皮質若干塊置于4%多聚甲醛固定6 h，移至30% 蔗糖溶液內，放4 ℃冰箱內，待腎組織下沉后，取出OCT包埋，放-80 ℃冰箱內待用。

2.5 Glut的免疫熒光染色 取冠狀位腎皮質連續冰凍切片，Glut-1、Glut-4各5張，厚8 μm，用H2O2與純甲醇浸泡腎片，水洗后滴加BSA封閉液，室溫20 min，甩去液體不洗。0.1% TritonX100-PBS浸泡2～3 min，碘化丙啶(PI)浸泡20 min，PBS洗后滴加1∶200的一抗(兔IgG)，37 ℃孵育1 h。漂洗后滴加二抗(FITC標記羊抗兔抗體)，37 ℃孵育20 min。PBS反復漂洗后，甘油-PBS封片，放4 ℃冰箱保存待檢。陰性對照用PBS代替一抗。

2.6 Glut檢測 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的氬離子激光系統，同時掃描FITC和PI標記的陽性反應物。掃描參數(機器設定)：激發光波長488 nm，觀測光波長518、576 nm，物鏡為40倍，Zoom：1.0[12]。經圖像分析儀攝像、分析大鼠腎皮質腎小球系膜細胞、上皮細胞Glut-1和Glut-4的表達情況。每張切片系膜細胞和上皮細胞各觀察10個視野。計算各視野綠色熒光陽性面積的百分率，以平均陽性率分析各組不同腎區內Glut的表達。

3 結果

3.1 各組大鼠24 h尿mALB定量的變化 灌胃后第4周、第8周，C組24 h尿mALB定量變化不大，DM組、TP組較C組明顯增加(P<0.01)，且DM組第8周較第4周亦增加(P<0.01)，TP組第8周較第4周明顯降低(P<0.01)。見表 1。

3.2 各組大鼠腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-1、Glut-4的表達 C組腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-1表達高于Glut-4。DM組系膜細胞及上皮細胞的Glut-1表達較C組明顯增加(P<0.05)，Glut-4的表達明顯減少(P<0.05)，差異有統計學意義。與DM組比較，TP組Glut-1表達較低(P<0.01)，Glut-4在系膜細胞的表達有所增高(P<0.05)，其在上皮細胞的表達與DM組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表 2。

表1 大鼠24 h尿mALB定量的變化(mg/24 h)

注：與C組比較，**P<0.01；與第4周比較，##P<0.01

表2 大鼠腎皮質內Glut-1和Glut-4的平均陽性率

注：與C組比較，*P<0.05；與DM組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

本研究結果顯示，DM組隨病情進展，24 h尿mALB明顯增加，提示腎小球的高濾過功能加強，用TP干預糖尿病大鼠模型4周后，24 h尿mALB減少，治療8周后，24 h尿mALB進一步減少，表明腎小球的高濾過功能有效改善，也證明TP對減少蛋白尿的產生和延緩糖尿病腎病有較好的治療作用[13]。

DM組腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-1的表達均明顯增加，Glut-1表達量增加引起過多的葡萄糖進入腎小球系膜細胞和上皮細胞，出現細胞內糖代謝的紊亂，若腎臟內多余糖分無法排除體外，可致系膜細胞肥大，細胞外基質增多，腎小球基底膜增厚，出現蛋白尿。因此，Glut-1的數量和功能狀態是決定細胞內糖代謝的一個重要閥門[4]，是DN發生、發展的關鍵因素。還有研究發現，DN患者腎小球內Glut-1的表達明顯增加，其表達強度與腎臟病變程度相關，并呈局灶節段性增強[14]。本實驗中，DM組腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-4表達均明顯減少，可進一步加重高糖引起的損害。有報道，DN時系膜細胞Glut-4表達受抑可以導致細胞對葡萄糖轉運障礙，引起的一系列變化可使DN病程進入不可逆階段[15]。因此，糖尿病時，腎小球系膜細胞和上皮細胞Glut-1的表達增高及Glut-4的表達減少均是腎臟受累的重要因素。

本研究中，TP組腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-1表達均顯著降低，表明TP能減少腎小球系膜細胞和上皮細胞的Glut-1的表達，即減少了高糖的直接與間接損傷作用，明顯減輕蛋白尿，減輕腎小球肥大和足細胞損傷、腎臟的炎癥和氧化應激，同時改善高脂血癥和肥胖癥[16]，延緩腎小球硬化和腎間質纖維化的進展并保護腎功能。TP組Glut-4在系膜細胞的表達增高，可促進葡萄糖的轉運和利用，從而降低血糖水平[17]。也有研究推測，任何能增加系膜細胞中Glut-4表達、促進Glut-4易位的因素均對糖尿病的腎臟有保護作用[14]。

綜上所述，早期應用TP可改善DM大鼠腎臟的組織病理學變化，最終延緩DN的發生和發展，其機制可能與其下調系膜細胞和上皮細胞Glut-1的表達量及功能活性，以及使Glut-4在系膜細胞的表達增高有關。

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Influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats

YOU Li-ju,GUO Hui,LI Yi-chuan

(Shangqiu Medical College,Shangqiu 476000,China)

Objective To discuss the influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats.Methods 45 rats were randomly divided into two groups according to weight: normal control group (group C,n=13) and diabetic model group (n=32).Rats in model group were intraperitoneally injected streptozotocin (STZ) 52 mg/kg for 5 d continuously; rats in group C were given intraperitoneal injection of equal volume of the buffer solution.At 72 h after the injection,the levels of fasting blood glucose and urine glucose were detected,and the rats with blood glucose≥16.7 mmol/L,urine glucose more than+++were included as the diabetes objects.The 28 male rats (successful model) were randomly divided into DM model group (DM group,n=14) and triptolide group (TP group,n=14).Results At the 4th and 8th weeks,the 24 h urinary mALB level in DM group and TP group significantly increased than that of group C (P<0.01),the mALB in DM group at the 8th week was higher than that at the 4th week (P<0.01),but the mALB in TP group at the 8th week reduced (P<0.01).The expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells in DM group increased more significantly than that of group C (P<0.05),and the expression of Glut-4 reduced (P<0.05).Compared with DM group,the expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells of group PT was significantly lower (P<0.01),the expression of Glut-4 in mesangial cells increased (P<0.05),no significant difference was found in the expression of epithelial cell (P>0.05).Conclusion Triptolide can significantly reduce the content of Glut-1 in glomerular mesangial and epithelial cells of diabetic nephropathy rats,increase the Glut-4 expression in glomerular mesangial cells.

Triptolide; Diabetic nephropathy; Rats; Glut-1; Glut-4

2014-09-24

商丘醫學高等專科學校，河南 商丘 476000

2011年河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2011C310003)

10.14053/j.cnki.ppcr.201504004