HPLC法測定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷含量

徐萬幫 蔣忠軍

廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180

HPLC法測定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷含量

徐萬幫 蔣忠軍

廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180

目的：對靈芝孢子紅景天膠囊中主要活性成分紅景天苷含量進(jìn)行測定。方法：以紅景天苷為指標(biāo)，采用HPLC法，測定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的含量，采用C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；甲醇：水（15∶85）為流動相；檢測波長275nm；流速為1.0ml／min；進(jìn)樣量10μl。結(jié)果：紅景天苷在0.005～5.4mg／ml濃度范圍內(nèi)峰吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系（R＝1），平均回收率為回收率在97.1%～108.9%。結(jié)論：本方法簡便可行，準(zhǔn)確可靠，可用于制劑的質(zhì)量控制。

紅景天苷；高效液相色譜法；高效液相色譜法；含量

靈芝孢子（Ganoderma lucidium spore）是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的孢子，富含多糖，三萜類化合物，維生素C、E，胡蘿卜素等多種生理活性物質(zhì)，具有抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。紅景天則含有苷類、黃酮類、香豆素類、氨基酸類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗輻射、提高缺氧耐受力、緩解體力疲勞、抗氧化等作用。靈芝孢子紅景天膠囊是以靈芝孢子粉、靈芝提取物、紅景天提取物、淀粉、葡萄籽等為主要原料制成的保健食品［2］。隨著人民生活水平的日益提高，對保健食品的需求在未來一段時間內(nèi)都會持續(xù)增長，目前國內(nèi)有少量企業(yè)生產(chǎn)靈芝孢子紅景天膠囊，為了更好的控制該膠囊的質(zhì)量，本實驗以香港某公司提供的靈芝孢子紅景天膠囊為基礎(chǔ)，以紅景天苷為質(zhì)量指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定紅景天苷來檢測靈芝孢子紅景天膠囊中主要成分紅景天的含量［3－5］，以期為靈芝孢子紅景天膠囊的質(zhì)量控制提供了有效地技術(shù)支持。

1 儀器和試藥

實驗儀器：美國安捷倫1200液相色譜儀（帶自動進(jìn)樣器，DAD檢測器等）；試藥：靈芝孢子紅景天膠囊 （香港某公司，批號為20130901～3）；紅景天苷對照品（批號為110818－201005，由中檢所提供）。甲醇購自默克公司，色譜純，其他試劑為分析純，去離子水為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 提取方法的選擇 超聲法：取靈芝孢子紅景天膠囊（批號20130903）適量，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10ml，稱定重量，超聲處理 （功率120W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，作為供試品溶液。

回流法：取供試品（批號20130903），按超聲法操作，將“超聲30min”改為“回流30min”，其余同超聲法制備。

取上述兩種溶液，分別取10ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。從表1可以看出，采用超聲法測定結(jié)果高于采用回流法，這是超聲萃取的效率高于傳統(tǒng)的加熱回流。

表1 不同提取方法的試驗結(jié)果（n＝3）

2.1.2 提取溶劑的選擇 為了獲得最優(yōu)提取溶劑，本實驗根據(jù)紅景天苷的溶解特性，分別采用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇作為溶劑進(jìn)行提取。取靈芝孢子紅景天膠囊（批號20130903），照3.1.1法中超聲法，分別用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇進(jìn)行提取制備供試品溶液，分別測定樣品中紅景天苷的含量。結(jié)果見表2。從表2可以看出甲醇的提取效率高于稀乙醇、水。這是由于紅景天苷更易溶于甲醇。

表2 不同溶劑試驗結(jié)果（n＝3）

2.1.3 提取時間的選擇 為了獲得最優(yōu)提取時間，取靈芝孢子紅景天膠囊（批號20130903）3份，以甲醇為提取溶劑，按超聲法，分別超聲處理15min，30min，60min，制成供試品溶液，分別測定紅景天苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 提取時間對紅景天苷含量的影響（n＝3）

從表3可以看出，隨著超聲時間的延長，樣品溶液中的紅景天苷濃度緩慢增加，到30min左右達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。可能原因是超聲15min時樣品中紅景天苷提取不完全。在超聲30min到達(dá)峰值后，繼續(xù)超聲提取，導(dǎo)致紅景天苷分解。因此選擇30min作為本品提取時間。

綜上，靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的最佳提取方法為：取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥過夜的紅景天苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含5mg的溶液，其他濃度的對照溶液，采用稀釋法稀釋制備，各濃度對照溶液冷藏，備用。

2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；紫外檢測器，以甲醇－水（15∶85）為流動相；檢測波長為275nm，流速為1.0ml／min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μl，以外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.4 方法專屬性 精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10ul，注入HPLC，記錄色譜圖，由色譜圖1－3提示，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑 （流動相）在此峰位置無吸收，對本品中紅景天苷含量測定沒有干擾，方法專屬性良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取濃度約為5mg／ml的紅景天苷對照品溶液100、10ml、2和1μl至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測定方法測定，記錄色譜圖。以對照品的濃度（mg／ml）為橫坐標(biāo)（x），測得的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y＝2817.x－26.86，r＝1。結(jié)果表明，紅景天苷對照品濃度在0.005～5.4mg／m l之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取濃度為0.54mg／ml的紅景天苷對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測定紅景天苷峰面積，此時，紅景天苷峰面積的RSD＝0.18%，表明儀器精密度良好

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一紅景天苷對照品溶液，分別在0，8，16和24h按上述色譜條件注入液相色譜儀，測定紅景天苷峰面積，此時紅景天苷峰面積的RSD＝0.57%，表明紅景天苷對照品溶液在此條件下穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性 取同一批供試品（批號20130903）6份，參照上述提取方法，按含量測定方法測定，記錄峰面積，計算含量，此時該批號靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的含量為12.97mg／g，RSD＝0.93%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率測定 取同一批已知含量（批號20130903）的供試品6份，按照樣品含量的100%將紅景天苷對照品溶液加入到樣品中，依上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行提取，制備回收溶液，注入高效液相色譜儀，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，共12次，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果（n＝2）

2.10 樣品測定 實測樣品3個，每個2份，共計6份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算紅景天苷含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品測試結(jié)果表

5 結(jié)論

本實驗采用甲醇為提取劑，用超聲萃取的方法提取靈芝孢子紅景天膠囊中的紅景天苷，提取效率高，具有良好的操作性。采用高效液相色譜法測定紅景天苷的含量，在紅景天苷含量為0.005～5.4mg／ml之間呈良好的線性關(guān)系，專屬性強(qiáng)，回收率在97.1%～107.0%之間，且操作簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，為靈芝孢子紅景天膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了技術(shù)支持。

［1］高歌，包海鷹，圖力古爾.納米級靈芝子實體粉末和破壁靈芝孢子粉體

外抗腫瘤活性研究［J］.菌物學(xué)報，2013，32（1）：114－127.

［2］靳榮光，王秋娟，劉繼平，等.紅景天苷治療冠心病相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（2）：213－215.

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［4］李元圓，何玉鈴，張永勛.HPLC法同時測定臺灣市售女貞子中紅景天苷、女貞子苷的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（2）：230－233.

［5］任艷艷，王曉琴，趙文彬，等.不同產(chǎn)地不同采收期薔薇紅景天中紅景天苷的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：377－378.

R284.2

B

1007－8517（2015）01－0034－03

2014.10.09）