敦煌平胃丸對胃癌前病變大鼠Notch信號通路中Notch2和Jagged1表達的影響

付 航劉喜平，2*張 煒李沛清

1.甘肅中醫學院基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫學院敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000

敦煌平胃丸對胃癌前病變大鼠Notch信號通路中Notch2和Jagged1表達的影響

付 航1劉喜平1，2*張 煒3李沛清1

1.甘肅中醫學院基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫學院敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000

目的：觀察敦煌平胃丸對胃癌前病變（PLGC）模型大鼠胃黏膜組織Notch信號通路中Notch2和Jagged1表達的影響。方法：采用復合法建立PLGC大鼠模型，將32只大鼠隨機分為4組，每組8只。敦煌平胃丸組用敦煌平胃丸浸膏按每日生藥96 g／kg摻入飼料中喂養給藥，共計12周。觀察大鼠胃黏膜病理組織學變化；采用Western Blot檢測Notch2和Jagged1蛋白表達；采用RT－PCR檢測Notch2和Jagged1mRNA的表達。結果：PLGC大鼠胃黏膜組織Notch2與Jagged1mRNA及蛋白表達較正常大鼠胃黏膜組織均明顯上調（P＜0.05）。敦煌平胃丸能明顯改善PLGC大鼠胃黏膜腺體萎縮、腸化增生，下調PLGC大鼠胃黏膜組織中Notch2與Jagged1表達水平（P＜0.05）。結論：Notch2、Jagged1激活了Notch信號通路，在PLGC發生發展中有重要意義。敦煌平胃丸治療PLGC可能與下調Notch信號通路中Notch2與Jagged1表達有關。

敦煌平胃丸；胃癌前病變；Notch2、Jagged1

胃癌前病變（gastric precancerous lesions，PLGC）是胃黏膜腸上皮化生（intestinalmetaplasia，IM）和異型增生（Dysplasia，Dys）的一種病理狀態。研究顯示Notch信號通路參與了胃黏膜的癌變過程［1］。敦煌平胃丸源于敦煌遺書，該方臨床治療慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變療效確切［2－3］。為了進一步揭示敦煌平胃丸的藥效及作用機理，本研究以PLGC大鼠為模型，研究了敦煌平胃丸對胃黏膜Notch信號通路中Notch2和Jagged1表達的影響，現報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物 采用SPF級健康Wistar大鼠，體重（160 ±10）g，雌雄各半，標準飼料喂養，均由甘肅中醫學院SPF級醫學實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（甘）2011－0001－0001163。

1.2 實驗藥物 敦煌平胃丸 （方藥組成：人參、土鱉蟲、當歸、苦參、大黃、桔梗、干姜、防風、篙本、玄參），藥材飲片購自蘭州復興厚藥材有限責任公司，經甘肅中醫學院中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規定。將處方中藥材飲片按一定比例，置多能提取器中，加水煎煮兩次，第一次加8倍量水，煎煮1.5h，第二次加6倍量水，煎煮1h，合并兩次煎液，離心濾過，濾液減壓濃縮至含生藥2g／m l的浸膏，保存備用。

1.3 試劑及儀器 甲基硝基亞硝基胍（MNNG），購自上海國藥集團化學試劑有限公司，批號M0527；Notch2及Jagged1抗體購自蘭州維科生物工程有限公司 （批號RMA0546）；胎牛血清購自蘭州維科生物工程有限公司；EastepTM通用型總RNA提取試劑盒：型號LS1OO，普洛麥格上海生物產品有限公司；RNAse－Exitus PLUS（德國Applichem公司），批號OD008558；超聲波破碎儀（德國merck公司）；超微量分光光度計 （K5500北京凱奧科技公司）；凝膠成像分析儀（170－8170，美國BIO RAD公司）；PCR熱循環儀（C1000，美國BIO RAD公司）。

2 方法

2.1 大鼠模型建立及分組給藥

2.1.1 PLGC大鼠模型建立 參考文獻方法［4］，采用復合法建立PLGC模型：用蒸餾水175ml和40℃50%的酒精75m l充分攪勻配成10g／l的母液250m l（每周配1次），于4℃冰箱保存。使用前將MNNG加入母液，稀釋成濃度為100μg／ml的溶液，避光保存。各造模組大鼠自由飲用MNNG與酒精復合溶液；各造模組大鼠雷尼替丁與60℃150g／熱鹽水按2.25g／L混合后灌胃。各造模組大鼠均配合饑飽失常（2d飽食，1d禁食）。

2.1.2 分組及給藥 32只大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為4組，每組8只：空白對照組，常規喂養；PLGC模型組，按照前述方法造模，常規喂養，共計12周；自然恢復組，按前述方法造模，常規喂養，共計12周，第13周造模結束后，繼續常規喂養12周；敦煌平胃丸組，按照前述方法造模，常規喂養，共計12周，第13周開始，按每日生藥96g／kg劑量（相當于60kg成人劑量的20倍計算），將敦煌平胃丸浸膏，摻入飼料中喂養12周。

2.2 各組大鼠胃黏膜病理組織觀察及積分 將大鼠禁食24h后 （自由飲水），腹部注射20%烏拉坦（約10m l／kg），剖腹取胃，沿胃大彎切開，PBS溶液漂洗2遍后，肉眼觀察大鼠胃壁彈性、黏膜色澤。剪取胃竇部胃組織，將其置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，染色，光鏡下觀察胃黏膜厚度，腺體排列及腸化增生情況。參考文獻方法 ［5］，分別從胃黏膜充血、炎性程度、胃黏膜糜爛程度、胃黏膜萎縮、腸化增生等方面進行評分。

2.3 Western Blot檢測各組大鼠胃黏膜組織Notch2和Jagged1蛋白的表達 取胃竇組織，每100mg組織加1m l預冷的蛋白提取試劑，提取組織蛋白質。超聲破碎儀粉碎組織，加入RIPA緩沖液勻漿，超微量分光光度計測蛋白質濃度；取100μl上清液，取相同質量的細胞裂解液，并加等體積的電泳加樣緩沖液，沸水浴中3min，上樣、電泳 （濃縮膠20mA，分離膠35mA），電轉膜儀轉膜（100mA 40min），膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色，Western blot ECL試劑盒顯色，采用博德公司的凝膠成像分析系統進行圖像采集，并用Quantity One4.2軟件分析目標條帶蛋白與β－actins蛋白的積分光密度比值，計算相對量。

2.4 RT－PCR檢測各組大鼠胃黏膜組織Notch2和Jagged1 mRNA的表達 取胃竇組織，提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。cDNA的合成采用5μl逆轉錄反應體系，42℃反應60m in。反應條件：變性，95℃，2min；退火，42～65℃，1min，25～35循環；延伸，72℃，5min。使用Promega公司的GO Tap Green Master Mix進行PCR擴增，將擴增物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物由采用Primer prem ier 5及Oligo 6等生物軟件進行引物設計，目的基因片段長度設計為100bp，內參片段長度設計為150bp。Notch2和Jagged1基因引物見表1。采用博德公司的凝膠成像分析系統進行圖像采集，并用Quantity One4.2軟件分析目標條帶mRNA與β－actins的mRNA的積分光密度比值，計算相對量。

表1 Notch2和Jagged1檢測中RT－PCR引物序列

2.5 統計學方法 用IBM SPASS 19.0統計軟件對數據結果進行處理分析，數據以均數 ±標準差 （）表示。采用單因素方差分析的方法，進行方差齊性檢驗后，組間的比較采用LSD與SNK法檢驗。檢驗水準為0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠胃黏膜組織病理觀察及積分 結果見圖1、表2。正常組大鼠胃黏膜腺體排列整齊，緊密呈管狀，細胞層次清晰，腺上皮及基底層細胞排列規則，黏膜下平滑肌層完整，沿上皮排列，未見特異改變；PLGC模型組大鼠胃黏膜腺體可見結構紊亂、形態不規則、排列擁擠、并有復層及背靠背現象，細胞核極性消失，胞核增大、深染、異形，核呈空泡狀，胞漿嗜堿，間質水腫，充血，淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞、嗜酸性細胞浸潤；自然恢復組大鼠胃黏膜結構紊亂，形態不規則，部分區域灶狀輕度增生腺或可見部分區域腸上皮化生；敦煌平胃丸治療組大鼠胃黏膜異型增生較模型組有不同程度改善，主要為炎性改變。

圖1 各組大鼠胃黏膜病例組織學變化

表2 各組大鼠胃黏膜病理組織評分（）

表2 各組大鼠胃黏膜病理組織評分（）

注：與空白對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3.2 各組大鼠胃黏膜組織Notch2和Jagged1蛋白的表達

結果見圖2、表3。與正常大鼠胃黏膜組織比較，PLGC模型組大鼠胃黏膜組織Notch2與Jagged1蛋白表達均明顯上調（P＜0.05）。自然恢復組有所降低，但不顯著。經敦煌平胃丸干預后Notch2與Jagged1蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），但仍高于正常組。

表3 各組大鼠胃黏膜組織Notch2及Jagged1的蛋白表達（）

表3 各組大鼠胃黏膜組織Notch2及Jagged1的蛋白表達（）

注：與空白對照組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

8 1.2976±0.3167 0.8970±0.0457 PLGC模型組 8 7.0527±0.0727Δ 1.5549±0.0076Δ自然恢復組 8 6.8478±0.0501Δ 1.0293±0.0891敦煌平胃丸組 8 1.7557±0.0659★ 0.9382±0.0541 Notch2 Jagged1空白對照組組別 例數★

3.3 敦煌平胃丸對PLGC大鼠胃黏膜組織Notch2 mRNA表達的影響 結果見表圖3、表4。與正常大鼠胃黏膜組織比較，PLGC模型組大鼠胃黏膜組織Notch2與Jagged1mRNA表達均明顯上調（P＜0.05）。自然恢復組有所降低，但不顯著。經敦煌平胃丸干預后Notch2與Jagged1mRNA達水平明顯下降（P＜0.05），但仍高于正常組。

表4 各組大鼠胃黏膜組織Notch2及Jagged1 mRNA的表達（）

表4 各組大鼠胃黏膜組織Notch2及Jagged1 mRNA的表達（）

注：與空白組相比，ΔP＜0.05；與模型組相比，★P＜0.05。

8 0.6948±0.0861 0.1116±0.0146 PLGC模型組 8 5.2342±0.2113Δ 3.6767±0.2419Δ自然恢復組 8 3.0933±0.0936Δ★ 2.4724±0.0122Δ敦煌平胃丸組 8 0.9245±0.0752Δ★ 0.3658±0.0468 Notch2 Jagged1空白對照組組別 例數Δ

4 討論

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，進化上高度保守［6］。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF－1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結合蛋白等組成。已知哺乳動物有Notch1、Notch 2、Notch 3、Notch4等4種Notch受體和Deltal、Delta3、Delta4、Jaggedl、Jagged2等5種配體。當Notch受體與鄰近的細胞表面的配體相結合時，其胞內區被切割，從細胞膜上脫離，轉運進入細胞核并與下游分子相互作用以傳遞Notch發揮生物學功能［7］。研究表明Notch信號轉導系統中Notch1－3受體及Jaggedl、Jagged2、Delta1等配體在正常胃黏膜中都有表達，在胃癌組織中則呈現高表達［8］，提示Notch信號通路可能參與了胃黏膜的癌變過程。但Notch信號通路是否參與了PLGC發生發展，尚未見到相關報道。

PLGC屬中醫“胃痞”范疇。中醫認為PLGC的發生是一個邪氣漸深，正氣漸傷的過程，這與 “慢性胃炎萎縮性胃炎腸上皮化生異型增生胃癌”的疾病模式有相似之處。胃黏膜炎癥經過長期病理演變，初起在經在氣，以脾胃失和，氣機阻滯為主，久則在絡在血，寒濕、郁熱、瘀血等邪毒蜂起，使胃絡不通；久則耗傷正氣，脾胃虛弱，氣陰虧虛，胃絡失于濡養，導致腺體萎縮、黏膜腸化增生，數證交錯，相互制，從而使病勢膠著，遷延不愈。故我們認為毒邪內蘊、胃絡不通、胃絡損傷是炎癥誘導PLGC發生的關鍵病機；脾虛陽陷、氣陰虧虛、胃絡失養是PLGC的病理轉歸；虛實夾雜、寒熱錯雜是其主要證候特征。

基于上述認識，我們提出 “消散毒邪，以通胃絡，升陽健脾、益氣養陰以養胃絡”治療PLGC的思路。敦煌平胃丸組方用藥符合這一治療思路，是我們臨床治療PLGC的常用方劑，療效顯著。該方源于敦煌遺書P·3287卷子［9］，由人參、土鱉蟲、當歸、苦參、大黃、玄參、干姜、防風、篙本、桔梗等組成。方中以土鱉蟲、大黃、當歸活血祛瘀，通經活絡，以解瘀毒阻滯胃絡；苦參、干姜辛開苦降，恢復中焦升降之職，以解寒濕、邪熱內蘊毒邪，佐以甘寒濡潤之玄參，與當歸合用滋陰養血，防止久病入絡，耗傷胃絡陰血，又可制約方中辛苦溫燥藥物傷及陰血；防風、篙本、桔梗均為辛散升浮之品，與人參配伍共奏升陽健脾。全方虛實兼顧，寒熱平調，潤燥結合；既消散毒邪，暢通胃絡，又升陽健脾、益氣養陰，榮養胃絡。

本研究結果表明PLGC模型大鼠胃黏膜組織Notch信號通路中受體Notch2與配體Jagged1mRNA及蛋白表達較正常大鼠胃黏膜組織均明顯上調。經自然恢復后這種高表達水平并未明顯改變，敦煌平胃丸則能明顯下調PLGC大鼠胃黏膜組織中Notch2、Jagged1 mRNA及蛋白表達水平。我們推測Notch2作為的受體、Jagged1作為配體激活了Notch信號通路，促進了胃黏膜腺體萎縮、腸化增生。敦煌平胃丸治療PLGC可能與下調Notch信號通路中Notch2與Jagged1表達，促進胃黏膜組織修復與重構有關。至于PLGC過程中是否還有其他Notch信號通路受體及配體或相關下游基因參與，敦煌平胃丸對其是否具有干預調節作用，有待于進一步研究。

［1］楊曉東，張輝，白志剛.Notch信號通路在胃癌組織中的表達及其意義［J］.中華普通外科雜志，2009，24（2）：146－148

［2］張炎.敦煌平胃丸加減治療慢性萎縮性胃炎56例療效觀察［J］.中國民族民間醫藥雜志，2010，（10）：175－175.

［3］劉喜平.敦煌醫方的理論與實踐［M］.北京：中醫古籍出版社，2012：75.

［4］謝晶日，王業莉，張揚，等.復合造模法建立大鼠胃癌前病變模型的實驗研究［J］.新中醫，2013，45（2）：139－140.

［5］孫寧，劉旺根，王雪萍，等.黃芪建中湯對脾虛型慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理形態影響的研究［J］.河南中醫學院學報，2005，9（5）：11－12.

［6］孫麗哲，侯林.Notch的結構功能和相關信號通路［J］.中國細胞生物學學報，2010，32（6）：914－921.

［7］Nam Y，Aster J C，Blacklow S C.Notch signaling as a therapeutic target［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6（4）：501.

［8］Sander GR，Powell BC.Expression of notch receptors and ligands in the adults gut［J］.Histochem Cytochem，2004，52（4）：509－516.

［9］劉喜平.敦煌 《亡名氏脈經》佚方考 ［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18（4）：362－365.

Effects of Dunhuang pingwei pill on expression of Notch2 and Jagged1 in the Notch signal pathway in rats w ith precancerous lesions of gastric cancer.

FU Hang1，LIU Xi-ping1，2，ZHANGWei3，LIPei-qing1
1.School of Basic Medical，Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Key Laboratory of Education Ministry“Dunhuang Medicine and Translation”from University of Traditional Medicine，Lanzhou 730000，China；3.Surgical Department of Lanzhou University First Hospital，Lanzhou 730000，China

Objective To observe the Dunhuang pingweipill on the expression of Notch2 and Jagged1 in the Notch signal pathway in ratswith precancerous lesions of gastric cancer.M ethods To establish the ratmodel of PLGC by using compositemethod，32 rats were random ly divided into 4 groups，8 rats in each group，Dunhuang pingwei pill group were fed with Dunhuang pingwei concrete according to daily crude drug 96 g／kg soak in feedstuff，a total of12 weeks.Observe changes in gastricmucosa pathological histology in rats.Using Western Blot to detect protein expression of Notch2 and Jagged1，the transcriptions of Notch2 and Jagged1mRNA were demonstrated by RT－PCR technique.Result Compared to the normal rats，Notch2 and Jagged1mRNA、protein expression were significantly up－regulated in gastric mucosa histology in rats with PLGC.（P＜0.05）.Dunhuang pingwei pill can obviously improve the gastric mucosa gland atrophy，intestinalmetaphases and hyperplasia，down－regulate the expression level of Jagged1andNotch2 in gastricmucosa tissue in ratswith PLGC.（P＜0.05）.Conclusion Notch2，Jagged1 activates Notch signaling pathways in PLGC，it is important to the developmentof PLGC.Dunhuang pingweipill in the treatmentof PLGCmaybe associated with down－regulating expression of Notch2 and Jagged1 in Notch signal pathway.

Dunhuang pingwei pill，PLGC，Notch2，Jagged1

R285.5

A

1007－8517（2015）01－0018－04

2014.10.07）

甘肅省高校基本科研業務費專項資金項目（編號：2011－3）。

劉喜平，男，教授，E－mail：lxpd－257＠163.com