UPLC－ELSD與UPLC－PDA測(cè)定山銀花中綠原酸的含量對(duì)比

趙留存葉世蕓*楊 春林昌虎郭 云趙 巡

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；3.貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001

UPLC－ELSD與UPLC－PDA測(cè)定山銀花中綠原酸的含量對(duì)比

趙留存1葉世蕓1*楊 春2林昌虎3郭 云1趙 巡1

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；3.貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001

目的：比較兩種檢測(cè)方法優(yōu)劣，為豐富山銀花藥材質(zhì)量控制方法提供參考。方法：采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1× 100mm，1.7μm）色譜柱，流動(dòng)相乙腈（A）－0.4%醋酸（B），梯度洗脫（0～2 min，7%A；2～2.3 min，7%A～28%A；2.3～10 min，28%A；10～10.5min，28%A～7%A），梯度流速（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35ml／min），PDA（二極管陣列檢測(cè)器）λ＝330 nm；ELSD檢測(cè)器，漂移管溫度60℃，噴霧器48℃，增益值100，氣體流速20psi，柱溫50℃。結(jié)果：PDA檢測(cè)綠原酸在0.3045～1.5225μg（R2＝0.9994）質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ELSD檢測(cè)綠原酸在0.3045～1.5225μg（R2＝0.9993）質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)論：PDA檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)受噪音影響較小，基線較平穩(wěn)，測(cè)得的數(shù)據(jù)比ELSD檢測(cè)器更準(zhǔn)確。

超高效液相色譜法；綠原酸；蒸發(fā)光檢測(cè)器；二極管陣列檢測(cè)器

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.－Mazz.、紅腺忍冬Lonicera confusa DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvoto－mentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花［1］。灰氈毛忍冬主產(chǎn)湖南、重慶和貴州，紅腺忍冬主產(chǎn)浙江、江西、福建、廣西等地，黃褐毛忍冬主產(chǎn)貴州等地［2］。其化學(xué)成分主要含有揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸和三萜類［3］，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效［4］。谷筱玉［5］用HPLC－UV－ELSD法、李紅霞［6］用HPLC法測(cè)定山銀花中綠原酸的含量，二者對(duì)山銀花中綠原酸的含量測(cè)定用紫外檢測(cè)器；盧鳳來［7］用HPLC－ELSD法、張璐［8］用HPLC－ELSD法測(cè)定山銀花中綠原酸的含量，二者用ELSD檢測(cè)器對(duì)山銀花中的綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。而國(guó)內(nèi)尚未見有山銀花含量測(cè)定的UPLC法報(bào)道。本文用UPLC法將紫外檢測(cè)器（PDA）與蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）串聯(lián)同時(shí)測(cè)定山銀花中綠原酸的含量，并對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選出了最佳測(cè)定方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 Waters UPLC H－Class超高效液相色譜儀，配有四元超高壓溶劑系統(tǒng)、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣本管理器、ELSD檢測(cè)器、PDA檢測(cè)器和Empower 3色譜工作站；電子分析天平 （XS20S）；超聲波清洗器（HS1026OD，天津奧康）。

1.2 材料 綠原酸（批號(hào)：110753－201314，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。山銀花分別采自貴州綏陽縣小關(guān)鄉(xiāng)、丹寨興仁鎮(zhèn)、金沙龍壩鄉(xiāng)、施秉縣白垛鄉(xiāng)和安順西秀區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華副教授鑒定，各地山銀花均為灰氈毛忍冬。乙腈為色譜純（德國(guó)Merck）；水為哇哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密量取對(duì)照品綠原酸6.09mg，用50%甲醇定容至10 ml即得。

1.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50m l，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.20μm微孔濾膜，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）色譜柱，流動(dòng)相乙腈（A）－0.4%醋酸（B）梯度洗脫（0～2 min，7%A；2～2.3 min， 7%A～28%A；2.3～10 min，28%A；10～10.5 min，28% A～7%A），梯度流速（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5 min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35ml／min），漂移管溫度60℃，噴霧器48℃，增益值100，氣體流速20psi，柱溫50℃。分別用PDA和ELSD兩種檢測(cè)器檢測(cè)綠原酸的含量。色譜圖如圖1、2。

2.2 線性關(guān)系考察 將綠原酸對(duì)照品按上述色譜條件分別進(jìn)樣0.5、1、1.5、2、2.5μl，測(cè)定峰面積。其中紫外檢測(cè)器測(cè)定綠原酸以峰面積Y對(duì)綠原酸對(duì)照品進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，而蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定綠原酸以峰面積Y的對(duì)數(shù)與相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品進(jìn)樣量X的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸。不同檢測(cè)器測(cè)定的線性方程見表1。

表1 綠原酸的線性方程（PDA與ELSD）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2μl，其中PDA檢測(cè)器測(cè)得的綠原酸的峰面積RSD為0.66%，ELSD檢測(cè)器測(cè)得的綠原酸峰面積的RSD為2.75%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次山銀花6份，按“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，其中PDA檢測(cè)器測(cè)得的綠原酸含量RSD為2.83%，ELSD檢測(cè)器測(cè)得的綠原酸含量RSD為1.89%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液，室溫避光放置，按“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果PDA檢測(cè)器與ELSD檢測(cè)器測(cè)得綠原酸的含量RSD分別為1.14%和1.61%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的綏陽縣山銀花樣品6份，分別加入對(duì)照品溶液17.10 mg，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每針進(jìn)樣1.5μl測(cè)定峰面積，分別計(jì)算UPLC法不同檢測(cè)器的回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測(cè)定 分別取五個(gè)不同產(chǎn)地的山銀花樣品，每個(gè)樣品稱取三份，按 “1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

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表3 樣品含量（n＝3）

由表3可知，同一產(chǎn)地山銀花中綠原酸的含量PDA檢測(cè)器測(cè)出的含量高于ELSD檢測(cè)器測(cè)出的含量，樣品中綠原酸的含量越高時(shí)二者測(cè)得的數(shù)據(jù)差距就越大。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取綠原酸對(duì)照品溶液，采用二極管陳列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，吸收光譜顯示綠原酸在219.0、245.2、324.0 nm處有最大吸收，參考《中國(guó)藥典》2010年版一部山銀花的含量測(cè)定方法綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm，因此本實(shí)驗(yàn)選取330nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)［1］。

3.2 PDA檢測(cè)器 PDA檢測(cè)器是通過化合物結(jié)構(gòu)中特定基團(tuán)對(duì)紫外光的吸收而對(duì)化合物進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)器，具有靈敏度高、線性范圍寬、使用方便、對(duì)流速和溫度不敏感等優(yōu)點(diǎn)，在液相色譜中應(yīng)用非常廣泛。但缺點(diǎn)是對(duì)無紫外吸收的化合物無法檢測(cè)［9］。ELSD作為一種通用型檢測(cè)器，既適用于有紫外吸收的化合物的測(cè)定，又適合于無紫外吸收的化合物的測(cè)定，其檢測(cè)范圍更廣泛一些［10］。本文通過兩種檢測(cè)方式對(duì)比，兩種檢測(cè)器都能測(cè)出山銀花中綠原酸的含量，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定的圖譜分析PDA檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)受噪聲影響較小，基線較平穩(wěn)，積分測(cè)得的數(shù)據(jù)比ELSD檢測(cè)器準(zhǔn)確，因此UPLC法測(cè)定山銀花中綠原酸的含量應(yīng)當(dāng)用PDA檢測(cè)器檢測(cè)更準(zhǔn)確一些。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 （一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：28.

［2］肖聰穎，汪冶，田蘭，等.關(guān)于 《中國(guó)藥典》金銀花、山銀花標(biāo)準(zhǔn)的幾點(diǎn)修訂建議［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（10）：1406－1407.

［3］王志萍，鄧家剛，王勤，等.山銀花研究的最新進(jìn)展 ［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11（4）：59－61.

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［9］陸云.高效液相色譜－紫外檢測(cè)－蒸發(fā)光散射檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2007.

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Comparing the differences between ELSD and PDA detectors of UPLC in detem inating chlorogenic aicd in Flos Lonicerae

ZHAO Liu－cun1YE Shi－yun1*YANG Chun2LIN Chang-hu3ZHAO Xun1GUO Yun1
1.Guiyang college of Traditionnal Chinese Medicine，Guiyang 550002，China；2.Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China；3.Guizhou Academy of Sciences，Guiyang 550001，China

Objective Compare twomethods of testing，and which onewas better.Provide a reference for rich Flos Loniceramedicinalmaterials quality controlmethod.M ethods ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）column was adopted and the temperature was 50℃.Two solution were acetonitrile（A）and 0.4%acetic acid（B），with the gradient elution of（0～2 min，A 7%；2～2.3 min，A 7%～28%；A 2.3～10 min，A 28%；10～10.5 min，A 28%～A7%），and velocity gradient（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35m l／min）.The detection waveleth was330 nm.Electronic Levelling Suspension，The temperature of drift tube wasmaintained at60℃，the temperature of nebulizer was 48℃，PMT was 100.with the nitrogen flow rate of 20 psi and column temprerature was 50℃. Results The linear response ranges of Chlorogenic Acid was 0.3045～1.5225μg（R2＝0.9994）with PDA and 0.3045～1.5225μg（R2＝0.9993）with ELSD respectively.Conclusion Photo－diode array was less about noise，more smooth about base line and more accurate about date than Evaporative Light－scattering Detector.

UPLC；ahlorogenic aicd；ELSD；PDA

R284.1

A

1007－8517（2015）01－0021－03

2014.09.29）

貴州省中藥現(xiàn)代化重大專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字（2012）6010號(hào)）。

趙留存（1984－），男（漢族），山東菏澤人，主要從事中藥質(zhì)量控制與新藥研發(fā)。E－mail：zhaoliucun＠126.com

葉世蕓（1966－），女（漢族），貴州貴陽人，教授，主要從事藥物分析的研究。E－mail：lihaolora＠sina.com