補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用研究

朱雪欽韓 靜胡 娟，龐文生，3*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；3.福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用研究

朱雪欽1韓 靜2胡 娟1，2龐文生1，3*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；3.福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

目的：探討補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法：采用線栓法制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，給藥組給予補陽還五湯原方劑量的水煎液，每日一次，連續(xù)灌胃7d；模型組與假手術(shù)組均給予同體積生理鹽水。測定SOD、GST和GSH－PX活性以及血清中MDA含量。結(jié)果：補陽還五湯可以顯著提高腦缺血再灌注大鼠SOD、GST、GSH－PX的活性，明顯抑制MDA的生成。結(jié)論：補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，抗氧化作用是其發(fā)揮腦缺血保護作用的機制之一。

補陽還五湯；MCAO大鼠模型；SOD；GST；GSH－PX；MDA

補陽還五湯是中醫(yī)益氣活血法的經(jīng)典方，由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花七味藥組成。臨床廣泛用于缺血性腦血管疾病，對灌注的大鼠皮層及小腦中活性氧 （ROS）的生成、對大鼠血管源性腦水腫的抗應(yīng)冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病均有作用［1］，可顯著抑制腦缺血／再激具有治療作用。大量研究顯示，補陽還五湯對抗腦缺血所致的氧化應(yīng)激損傷具有神經(jīng)保護作用［2，3］。本文將采用線栓法制作大鼠腦缺血／再灌注（MCAO）模型，并通過測定SOD、GST和GSH－Px活性以及MDA的含量，著重觀察補陽還五湯經(jīng)典方在大鼠腦缺血／再灌注損傷中的抗氧化作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重250±20g，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 實驗儀器 VF3001全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（美國）。

1.3 藥物與試劑 黃芪（批號：1203131，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；當(dāng)歸尾（批號：1203046，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；赤芍（批號：1203072，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公）；地龍（批號：1112207，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；川芎（批號：1203055，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；桃仁（批號：120201，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；紅花（批號：1203083，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；氯化鈉（批號：F20110307，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；SOD、GSH－Px和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GST試劑盒 （上海生工生物技術(shù)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備 采取線栓法制作大腦中動脈閉塞／再灌注模型［4］。動物術(shù)前禁食12h，自由飲水。用10%水合氯醛3ml／kg行腹腔注射麻醉。鈍性分離右側(cè)右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、和頸內(nèi)動脈（ICA），并小心分離迷走神經(jīng)，分別電凝ECA分支枕動脈和甲狀腺上動脈。在距CCA分叉大約1cm處結(jié)扎ECA近心端，電凝遠(yuǎn)心端。用無創(chuàng)小動脈夾夾閉CCA，在ECA殘端距CCA分叉3mm處剪一小口，將制備好的線栓經(jīng)ECA插入ICA，線栓頭端距CCA分叉處約18mm，此時進線有輕微阻力，栓線正好插至顱內(nèi)的大腦前動脈，堵住大腦中動脈 （MCA）開口，制成MCAO模型。造模后2h，以半劑量10%水合氯醛再次麻醉動物，拔出線栓，結(jié)扎ECA殘端。術(shù)后20～25℃條件下飼養(yǎng)大鼠，自由進食水。假手術(shù)組除不在頸內(nèi)動脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。

1.4.2 分組與給藥 將21只大鼠隨機分成3組，每組7只，分別為模型組、給藥組、假手術(shù)組。給藥組給予補陽還五湯煎劑原方劑量，黃芪120g，當(dāng)歸尾6g，赤芍5g，地龍3g，川芎3g，桃仁3g，紅花3g。用水煎煮兩次合并混勻。模型組與假手術(shù)組均給予生理鹽水。每日一次，連續(xù)給藥7d。

1.4.3 SOD、GST、GSH－Px的活力測定 大鼠于缺血再灌注24h后斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)大腦皮質(zhì)適量，在冰浴中勻漿，用0.9%生理鹽水制成10%的組織勻漿液。4000r／min離心10 min，取上清。采用WST－1方法測定腦組織中SOD活力，CDNB法測定GST活力，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定GSH－Px活力。

1.4.4 MDA的含量測定 按“1.4.3”中的方法獲得腦組織勻漿液，采用硫代巴比妥法測定腦組織中MDA含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差 （）來表示，組間差異用t檢驗分析結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 實驗結(jié)果

模型組與假手術(shù)組比較，SOD的活力顯著降低 （P＜0.01），GST的活力顯著降低（P＜0.01），GST的活力顯著降低（P＜0.01），GSH－Px的活力顯著降低（P＜0.01），其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；補陽還五湯組與模型組比較，SOD的活力顯著提高（P＜0.05），GST的活力顯著提高（P＜0.05），GSH－Px的活力顯著提高（P＜0.05），其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；模型組與假手術(shù)組比較，MDA含量顯著升高（P＜0.01），其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；補陽還五湯組與模型組比較，補陽還五湯組顯著降低MDA含量（P＜0.05），其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 補陽還五湯對MCAO大鼠腦組織MDA含量和SOD、GST、GSH－Px活力的影響（n＝7，）

表1 補陽還五湯對MCAO大鼠腦組織MDA含量和SOD、GST、GSH－Px活力的影響（n＝7，）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 SOD（U／mg） GST（U／mg） GSH－Px（U／mg） MDA（nMol ）.18模型組 115.00±9.43＃ 79.26±9.95＃ 211.11±34.43＃ 1.10±0.19＃補陽還五湯組 136.85±25.94* 101.48±25.14* 234.34±40.44* 0.90±0.16假手術(shù)組 105.47±8.47 71.08±3.90 202.00±10.66 1.35±0 *

3 討論

腦血管疾病以高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率己成為嚴(yán)重威脅人類生命與健康的主要疾病之一，隨著我國老齡化社會的到來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。腦血管疾病主要包括缺血性和出血性腦卒中，其中以缺血性腦卒中最常見，而大腦中動脈 （MCA）是人群腦缺血的多發(fā)部位。

超微補陽還五湯能明顯降低組織內(nèi)的血漿丙二醛（MDA）和增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，并增強大鼠腦組織神經(jīng)生長因子 （NGF）的表達［5］；加味補陽還五湯對8Hz 130dB次聲暴露下小鼠大腦過氧化水平及超微結(jié)構(gòu)具有改善作用［6］?；蛐酒治鲅a陽還五湯對局灶性腦缺血再灌注大鼠保護作用機制的研究顯示，該方可上調(diào)多種抗氧化酶的基因，包括谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶 （GST），谷胱甘肽過氧化物酶－1（Gpx－1）、硫氧還蛋白（Tdpx1）等［7］。大量研究顯示，補陽還五湯對抗腦缺血所致的氧化應(yīng)激損傷而具有神經(jīng)保護作用。自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷廣泛參與腦缺血性中風(fēng)的神經(jīng)病理機制。缺血性中風(fēng)發(fā)生時，神經(jīng)元由于失去氧和葡萄糖的供應(yīng)，不能維持其靜息電位而使得動作電位發(fā)放，興奮性氨基酸異常釋放，過度增加的興奮性氨基酸又進一步激活神經(jīng)元使之去極化，促使Ca2＋大量內(nèi)流，Ca2＋超載激活多種細(xì)胞酶，使自由基大量生成，造成神經(jīng)元應(yīng)激和死亡。自由基使膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞功能，且過多的自由基會造成神經(jīng)元持續(xù)而致命的損傷［8］。脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物 （MDA）有很強的毒性和反應(yīng)性，它們可使脂質(zhì)過氧化在細(xì)胞膜系統(tǒng)蔓延導(dǎo)致細(xì)胞功能的破壞，所以測量MDA的含量被認(rèn)為是氧自由基損傷的重要指標(biāo)。在正常狀態(tài)下，機體ROS的產(chǎn)生和清除間存在著動態(tài)的平衡，產(chǎn)生的自由基可被SOD、GSH－Px、GST等抗氧化酶清除，故測定抗氧化酶類的活性可以間接反映體內(nèi)清除自由基的能力變化。腦缺血再灌注時，機體ROS的生成過多，超過了抗氧化酶對它的清除，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。腦缺血大鼠再灌注后，SOD、GSHPx、GST活性顯著降低，MDA含量明顯升高，表明腦缺血再灌注期脂質(zhì)過氧化增加，機體抗氧化能力降低。本實驗的測定結(jié)果顯示補陽還五湯能顯著提高SOD、GSH－Px、GST的活性，降低MDA的含量，表明補陽還五湯對腦損傷的保護作用與其抗氧化作用有關(guān)，藥物的作用機制可能為通過提高缺血再灌注腦組織SOD、GST、GSH－Px等抗氧化酶的活性，從而能清除氧自由基，起保護作用。

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The Protection and M echanism of Buyang huanwu tang on Focal Cerebral Ischem ia－Reperfusion in Rats

ZHU Xue-qin1HAN Jing2HU Juan1，2PANGWen-sheng1，3*
1.FuJian University of Traditional Chinese Medicine of Pharmacy，F(xiàn)uzhou 350122，China；2.FuJian Institute of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China；3.Fujian Seeond Peopleis Hospited.Fuzhou 350000，China

Objective To investigate the protection andmechanism of Buyang huanwu tang on focal cerebral in rats.Methods Focal cerebral ischemia－reperfusion modelwasmadewith sutur－occludedmethod in rats.Dose group was given Buyang huanwu tang，Model group and Sham group were given physiological saline.Then they were given once a day for seven consecutive days.The volume of cerebral in farction，the level of MDA in serum，the activities of SOD、GST and GSH－Px in serum were rileasured.Resu lts Buyang huanwu tang could increase the activities of SOD、GST and GSH－Px in serum and decrease MDA level.Conclosion Buyang huanwu tang has significant protection again cerebral ischemia－reperfusion injury.This effectmay be related to its antioxidant property.

Buyang huanwu tang；Cerebral Ischemia－Reperfusion Injury；SOD；GST；GSH－PX；MDA

R285.5

A

1007－8517（2015）01－0042－02

2014.09.30）

福建省中醫(yī)藥研究院自主選題（2012fjzzyk－4）資助項目。

朱雪欽，女，在讀碩士研究生，從事天然藥物化學(xué)研究。E－mail：343138655＠qq.com

龐文生，E－mail：pws＠fjtcm.edu.cn