止咳枇杷顆粒微生物限度檢查方法驗證

郭秀秀

安徽省宿州市食品藥品檢驗所，安徽 宿州 234000

止咳枇杷顆粒微生物限度檢查方法驗證

郭秀秀

安徽省宿州市食品藥品檢驗所，安徽 宿州 234000

目的：止咳枇杷顆粒的微生物限度檢查的方法驗證。方法：按 《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法規定的方法進行驗證試驗。結果：大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規法驗證回收率均大于70%。結論：止咳枇杷顆粒的細菌、霉菌和酵母菌的計數方法可采用常規法，控制菌可采用常規法檢驗。

止咳枇杷顆粒；微生物限度檢驗法；方法驗證

止咳枇杷顆粒是一種常用中成藥，具有清肺、止咳、化痰的作用，用于咳嗽多痰。處方由枇杷葉、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷腦六味中藥組成，其中桔梗、百部、薄荷腦均具有一定的抑菌作用［1］。《中國藥典》2010版附錄Ⅻ－ⅠC微生物限度檢驗方法中規定，建立藥品的微生物限度檢驗方法必須進行方法驗證，確證供試液制備、測定方法及檢測系統適用于該藥品的檢驗，保證微生物限度檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性。本文參照2010年版 《中國藥典》［2］、《中國藥品檢驗標準操作規范》［3］進行試驗，對止咳枇杷顆粒的微生物限度檢驗方法進行方法驗證，結果表明細菌、霉菌及酵母菌計數可采用常規法、控制菌檢查可采用常規法。

1 試驗環境與材料

1.1 試驗環境 根據2010年版《中國藥典》規定，試驗在環境潔凈度10000級、局部潔凈度100級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內進行。

1.2 實驗儀器 BHC－1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；GHP－9162型電熱恒溫培養箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX－160B－Z型微電腦霉菌培養箱 （上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DYXDHS型隔水式電熱恒溫培養箱 （上海躍進醫療器械廠）；YXQ－LS－75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業有限公司醫療設備廠）；TZQ－Ⅱ型勻質器型號 （天津市津德實驗儀器技術開發中心）。

1.3 供試品 止咳枇杷顆粒（批號：20140429、20140501、20140502，安徽省雪楓藥業有限公司）。

1.4 驗證菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44 102］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63 501］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98 001］均由中國醫學菌種保藏中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98 003］由中國藥品生物制品檢定所提供，試驗用菌株的傳代次數為3代。

1.5 培養基 營養瓊脂培養基（批號：121130）、玫瑰紅鈉瓊培養基 （批號：110811）、營養肉湯培養基 （批號：110406）、改良馬丁培養基（批號：130227）、曙紅亞甲藍瓊脂培養氧基（EMB，批號：1110102）、膽鹽乳糖培養基（批號：1111162）、4－甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG，批號：1110102）均由北京三藥科技開發公司提供。

根據2010年版《中國藥典》附錄Ⅻ－ⅠC的規定，計數培養基符合計數培養基適用性檢查的要求；控制菌檢查用培養基符合促生長、指示和抑制能力的要求。

1.6 稀釋劑 0.9%無菌氯化鈉溶液（蚌埠豐原涂山試劑有限公司）；pH7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液 （杭州微生物試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌在營養肉湯培養基中33℃培養24h，各取1ml培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10－5、10－7、10－7，備用；白色念珠菌在改良馬丁液體培養基中經25℃培養24h，取培養物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10－5，備用；黑曲霉在改良馬丁斜面培養基中經25℃培養1周，用5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取經無菌棉花過濾的孢子菌懸液1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10－6，備用。

2.2 菌懸液中含菌量檢驗 取“2.1”中枯草芽孢桿菌10－5級稀釋液1m l放入已滅菌的平皿中，用45℃無菌營養瓊脂培養基20ml注皿且平行測定兩皿，33℃培養48h計數；取10－7級金黃色葡萄球菌、10－7級大腸埃希菌分別注皿培養，方法及培養條件同枯草芽孢桿菌。取 “2.1”中白色念珠菌10－5級稀釋液1ml放入已滅菌的平皿中，用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20ml注皿，平行測定兩皿，25℃培養5d逐日觀察計數；取10－6級黑曲霉孢子菌懸液1ml注皿培養，方法及培養條件同白色念珠菌。

所有患者均接受MSCT診斷，采用128排螺旋CT機進行掃描，儀器型號為西門子SIEMENS128層AS+，相關參數設置：層厚0.625mm，轉速0.35s/周，電壓120kV，自動毫安（480～680mA），重建野及顯示野25cm，標準算法，掃描野Large，重建層厚0.625mm，間隔0mm，從器官隆突處向下掃描至心臟膈面。在PR間期R波后75%R-R間期時相實施重建選取質量較佳的對象做最后觀察分析，采用碘普羅胺作為對比劑，規格為370mgI/mL，采用雙筒高壓注射器Stellan Medrad，對比劑總量0.9mL/kg，采用30～40mL生理鹽水，注速5mL/s。

根據2010年版 《中國藥典》規定，細菌、霉菌和酵母菌方法驗證所用菌懸液含菌量應為50～100 cfu／m l；控制菌方法驗證所用菌懸液含菌量為10～100 cfu／ml。結果見表1，符合要求。

表1 菌懸液中含菌量 ／cfu／ml

2.3 供試液制備 取本品最小包裝兩袋（10g／袋），按微生物限度檢查法規定稱取10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100m l，勻漿儀2000轉／min，3min混勻，即為1∶10的供試品溶液。

2.4 細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證

2.4.1 常規法 按照2010年版《中國藥典》規定需進行3次獨立的平行試驗，且每次每種菌種需平行2皿。

2.4.2 試驗組 取1∶10供試液1m l，枯草芽孢桿菌10－5級菌懸液1m l，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌營養瓊脂培養基20m l，待凝固后置33℃陽性細菌培養箱中倒置培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌同枯草芽孢桿菌。取1∶10供試液1m l，白色念珠菌10－5級菌懸液1m l，注入無菌平皿，立即傾注45℃無菌玫瑰紅鈉培養基20m l，待凝固后置25℃陽性霉菌培養箱中倒置培養5d，逐日觀察結果并記錄。黑曲霉同白色念珠菌。

2.4.3 菌液組 取枯草芽孢桿菌10－5級、金黃色葡萄球菌10－7級、大腸埃希菌10－7級菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后置33℃細菌陽性培養箱中培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。取白色念珠菌10－5級和黑曲霉10－6級菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后置25℃霉菌陽性培養箱中培養5d，逐日觀察結果并記錄。

2.4.4 供試品對照組 取1∶10供試液1m l，注入平皿，立即傾注45℃無菌營養瓊脂培養基或45℃無菌玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后營養瓊脂培養基置陰性細菌培養箱中33℃培養24～72h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置陰性霉菌培養箱中25℃培養5d，逐日觀察結果并記錄。

2.4.5 稀釋劑對照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液1m l，枯草芽孢桿菌10－5級1m l，注入平皿，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后置33℃細菌陽性培養箱中培養24～72h，逐日觀察結果并記錄；金黃色葡萄球菌10－7級、大腸埃希菌10－7級方法同枯草芽孢桿菌。取0.9%無菌氯化鈉溶液1m l，白色念珠菌10－5級1m l，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后置25℃陽性霉菌培養箱中培養5d，逐日觀察結果并記錄。黑曲霉10－6級菌懸液方同白色念珠菌。

2.4.6 實驗結果 從表2可知，3次平行試驗枯草芽孢桿菌、大腸埃細菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的試驗組和稀釋劑對照組的回收率均大于70%，根據 《中國藥典》2010版規定，可以采用常規法測定供試品中細菌、霉菌和酵母菌數。

表2 細菌、霉菌和酵母菌常規法計數方法的驗證結果 ／cfu

2.5 控制菌 （大腸埃希菌）檢查方法驗證

2.5.1 常規法 按照2010年版《中國藥典》規定需進行3次獨立的平行試驗，且每次每種菌種需平行2皿

2.5.2 試驗組 取已滅菌的裝有100m l膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10m l，10－7級大腸埃希菌菌懸液10m l，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.3 陰性對照組 取已滅菌的裝有100m l膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入0.9%無菌氯化鈉溶液10m l，置35℃陰性培養箱中培養24h，按大腸埃細菌的檢查法檢查。

2.5.4 陽性對照組 取已滅菌的裝有100m l膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入10－7級大腸埃希菌菌懸液10m l，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.5 供試品組 取已滅菌的裝有100m l膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1∶10供試液10m l，置35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.6 陰性菌對照組 陰性對照菌采用10－7級金黃色葡萄球菌，方法同試驗組。

2.5.7 實驗結果 由表3可知，大腸埃希菌陽性組、試驗組生長良好，說明止咳枇杷顆粒對大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱，可以采用常規法檢查。

3 結果與討論

3.1 上述驗證結果 止咳枇杷顆粒采用常規法測定細菌、霉菌及酵母菌的試驗組和稀釋劑對照組回收率均大于70%，說明可以采用常規法對細菌、霉菌、酵母菌及控制菌中大腸埃希菌進行檢驗且采用0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋劑對試驗不產生影響。

表3 大腸埃細菌方法驗證實驗結果

3.2 方法驗證中陽性菌會造成環境污染 必須嚴格按照2010年版 《中國藥典》附錄中方法驗證的規定，在無菌室的生物安全柜內操作，做好防護措施。同時供試品組及陰性對照組應在符合規定的潔凈室內操作。

3.3 方法驗證需進行三次獨立的平行實驗 為使結果獲得良好的重現性，所加的培養基體積應盡量一致，培養基與所加試液應充分混合均勻。

3.4 菌落計數 菌落計數是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，因此計數時應仔觀察，必要時可借助放大鏡等工具，排除藥渣和小氣泡的干擾，減少操作誤差。

［1］南京中醫藥大學.中藥大辭典 ［M］.上海：上海科學技術出版社，2006：833－5553.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典 （一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：107－116.

［3］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范［S］.北京：中國醫藥科技出版社.2010：351－369.

Research on the determ ination of Validation method for m icrobial lim its test of Pibazhike Granule

GUO Xiuxiu
Anhui Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，China

ObjectiveTo establishmicrobial limit test for Pibazhike Granule.Methods Themethodswere according to Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition Appendixmicrobial limit testmethod.Rusults The recoverieswere over70%when routinemethod was used with escherichia coli，bacillus subtilis，aspergillusniger，candida albicans，staphylococcusaureus.Conclusion It is effective and feasible thatbacteria，filamentons fungiand yeast countwere detected with routinemethod；Control bacteria can be tested by using the conventionalmethod.

Pibazhike Granule；microbial limits test；method validation

R921.2

A

1007－8517（2015）13－0008－02

2015.04.02）