高脂致非酒精性脂肪肝動物模型肝臟形態(tài)學動態(tài)研究

譚麗萍石安華馬 潔姚 政殷 華陳文慧*

1.云南中醫(yī)學院實驗中心，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，云南 昆明 650500

高脂致非酒精性脂肪肝動物模型肝臟形態(tài)學動態(tài)研究

譚麗萍1石安華2馬 潔2姚 政2殷 華2陳文慧2*

1.云南中醫(yī)學院實驗中心，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，云南 昆明 650500

目的：利用高脂飼料建立非酒精性脂肪肝動物模型，為非酒精性脂肪肝的中藥治療效果提供基礎。方法：將70只清潔級SD大鼠隨機分為2組，即正常組20只、模型組50只，正常組隨機分為5組，每組4只；模型組隨機分為5組，每組10只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。于第四周、第六周、第八周、第十周、第十二周分別處死1組正常組和1組模型組。觀察大鼠肝臟大體觀，稱量肝臟濕重，計算大鼠肝體比，并將肝臟進行石蠟切片HE染色和冰凍切片蘇丹三染色。結果：從第四周末開始，模型組大鼠肝濕重增高，與正常組大鼠肝濕重比較差異具有統(tǒng)計學意義，并在第六周末、第十周末、第十二周末出現(xiàn)顯著差異。從第六周末開始模型組肝指數(shù)增高與正常組肝指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學意義。肝臟鏡下觀從第四周開始出現(xiàn)輕度脂肪肝，并隨著造模時間的延長，不斷加重。結論：利用常規(guī)高脂飼料 （88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇）造非酒精性脂肪肝動物模型，于造模后第四周即出現(xiàn)非酒精性脂肪肝，并隨著時間延長不斷加重。

高脂；非酒精性脂肪肝；模型

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）俗稱脂肪肝，是指以肝實質細胞脂肪變性為病理特征而無過量飲酒史及其他肝病的臨床綜合征，其病理類型包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）及NASH相關肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌［1－2］。隨著生活水平的不斷提高，人們從飲食中攝取的高脂物質越來越多，出行交通便利，工作壓力大，運動量減少，導致其發(fā)病率逐年上升。課題組致力研究活血化瘀方對非酒精性肝病的治療效果，成功建立了NAFLD的模型，為今后的治療研究提供了良好地基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，清潔級，體重（100± 10）g，70只。購自四川省成都達碩生物有限公司，許可證號：SCXK（川）2014－23。

1.2 實驗儀器以及試劑 豬油自制；膽固醇 （批號：20130201，安徽天啟化工科技有限公司）；YP10002電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；YD1508B輪式切片機（浙江金華益迪醫(yī)療設備廠）；HI1220烘片機（德國LEICA公司）；HI1210攤片機（德國LEICA公司）；CM1860UV冷凍切片機（德國LEICA公司）

1.3 高脂飼料的配制［3］88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇。

1.4 實驗方法 將70只清潔級雄性SD大鼠隨機分為2組，即正常組20只、模型組50只，正常組隨機分為5組，每組4只；模型組隨機分為5組，每組10只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。各組自由飲水。1.5 處理方法 大鼠實驗前禁食不禁水12h，次日以10%水合氯醛溶液0.25ml／100g進行腹腔注射麻醉。取血后，處死大鼠，迅速取肝組織稱重。后將肝臟浸泡于10%中性福爾馬林內固定，進行石蠟切片和冰凍切片。

1.6 診斷標準

1.6.1 脂肪肝病理診斷標準［4］低倍鏡下，肝細胞脂肪變性占肝小葉1／3～1／2者為輕度脂肪肝；占肝小葉1／2～3／4者為中度脂肪肝；占肝小葉3／4以上或者肝細胞彌漫脂肪性變性呈漁網狀者為重度脂肪肝。

1.6.2 肝指數(shù)的測定［4］動物處死后，立即取肝臟，濾紙吸干表面水分后稱其濕重，計算肝指數(shù)：肝指數(shù)＝肝臟重量（g）／體重（g）×100%。

1.7 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差 （±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重、肝濕重以及肝指數(shù)變化情況 由表1可知，隨著時間的延長，大鼠體重在不斷增加，但各時間段正常組和模型組之間沒有統(tǒng)計學差異。從第四周末開始，模型組大鼠肝濕重增高，與正常組大鼠肝濕重比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并在第六周末、第十周末、第十二周末出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；從第六周末開始模型組肝指數(shù)增高與正常組肝指數(shù)對比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 正常組和模型組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)比較 （±s）

表1 正常組和模型組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)比較 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 體重／g 肝濕重／g 肝指數(shù)／% 4周正常組（n＝4） 270.55±19.95 8.70±0.72 3.22±0.26 4周模型組（n＝10） 279.65±24.64 10.01±1.63* 3.59±0.57 6周正常組（n＝4） 330.30±31.21 8.98±0.98 2.76±0.16 6周模型組（n＝10） 358.50±30.21 11.20±1.03** 3.07±0.13**8周正常組（n＝4） 364.21±42.85 9.44±1.86 2.58±0.29 8周模型組（n＝10） 367.22±47.01 11.79±1.93* 3.22±0.26**10周正常組（n＝4） 410.18±25.55 8.88±0.47 2.20±0.16 10周模型組（n＝10） 431.48±64.67 12.67±3.27** 2.90±0.37**12周正常組（n＝4） 410.33±34.93 9.66±0.97 2.36±0.21 12周模型組（n＝10） 437.00±32.24 13.89±1.84** 3.18±0.32**

2.2 肝臟病理學變化

2.2.1 肝臟肉眼觀察結果 正常組大鼠肝臟顏色為均勻的暗紅色，邊緣銳利，質韌。模型組肝臟體積明顯增大，顏色呈現(xiàn)紅黃相間，并隨著時間的延長肝臟顏色越來越白，邊緣變圓鈍，包膜緊張，質地變脆。見圖1。

2.2.2 肝臟鏡下觀察

2.2.2.1 不同造模時間各個實驗組動物肝臟脂肪變性情況正常組大鼠肝臟全部正常，沒有發(fā)生脂肪變性，第四周模型組大鼠肝臟輕度脂肪肝占100%；第六周模型組輕度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占80%，重度脂肪肝占10%；第八周模型組輕度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占20%，重度脂肪肝占70%；第十周模型組中度脂肪肝占10%，重度度脂肪肝占90%；第十二周模型組重度脂肪肝占100%。具體見表2。

2.2.2.2 肝臟病理組織學描述 各周次正常肝組織石蠟切片HE染色、冰凍切片蘇丹三染色鏡下結構均正常，肝血竇清晰，肝索以中央靜脈為中心呈現(xiàn)放射狀，肝細胞結構清晰，細胞質豐富，細胞核位于細胞中央。見圖2

表2 正常組和模型組大鼠肝臟脂肪變性程度的統(tǒng)計

石蠟切片HE染色，第四周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細胞內出現(xiàn)少量的微小的脂肪空泡，肝索、肝血竇較清晰；第六周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)中度脂肪變性，肝細胞內出現(xiàn)中等量大小不等的空泡，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第八周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細胞內有大量大小不等的脂滴，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第十周、十二周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細胞內有大量大小不等的脂滴，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，并伴隨肝細胞點狀壞死和少量炎細胞的浸潤。見圖3。

冰凍切片蘇丹三染色，第四周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細胞內出現(xiàn)少量的橘紅色的脂滴，肝索、肝血竇較清晰；第六周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)中度脂肪變性，肝細胞內出現(xiàn)中等量橘紅色的脂滴，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第八周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細胞內有大量橘紅色的脂滴，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第十周，第十二周模型組肝組織、肝細胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細胞內有大量大小不等的脂滴，肝細胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，肝細胞點狀壞死。見圖4。

3 討論

隨著非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年升高，科研工作者對該疾病的研究越來越多，如何建立與人類疾病特征相似的非酒精性脂肪肝動物模型，是研究該疾病的首要問題。建立非酒精性脂肪肝動物模型的方法很多，動物模型飼料配方有：高糖飲食，80%普通飼料＋20%蔗糖［4］；高脂飲食，在基礎飼料中加入質量分數(shù)為0.01的膽固醇，0.1的豬油，0.1的蛋黃粉，0.002的膽鹽［6］；改良高脂飼料，膽固醇2%，膽酸鈉05%，丙硫氧哮吮0.2%，蔗糖5%，豬油10%，基礎飼料82.3%［3］等。理想的動物模型應當具備以下條件：與人類疾病特征相似；病變有一定發(fā)展過程，與人類發(fā)病過程接近；形成率高，死亡率低，重復性好；造模方法簡便易行［5］。本實驗所采用的常規(guī)高脂飼料（88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇），配方簡單，于第四周開始肝組織出現(xiàn)輕度的脂肪變性，成功的建立了非酒精性脂肪肝動物模型，為后續(xù)非酒精性脂肪肝的實驗研究提供了堅實的基礎。

［1］Farrell GC，Chitturi S，Lau GK，et al.Asia－Pacific Working Party on NAFLD.Guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia－Pacific region：executive summary［J］.JGastroenterol Hepatol，2007，22：775－777.

［2］中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（1）：161－163.

［3］王倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進 ［J］.世界華人消化雜志，2007，15（11）：1219－1224.

［4］劉嵩，盧笑叢，葛建，等.高脂所致脂肪肝動物模型建立的動態(tài)研究［J］.中國藥理學通報，2006，22（11）：1399－1403.

［5］蘇琳，劉玉蘭.高糖飲食及高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型的比較［M］.實驗動物科學，2009，26（3）：14－17.

［6］中國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術規(guī)范［S］.2003：35.

Study on dynam icmorphological liver fatty liver animalmodel of nonalcoholic induced by high fat

TAN Liping1SHIAnhua2MA Jie2YAO Zheng2YIN Hua2CHENWenhui2*
1.Experimental center Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.Basic Medical College of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500 China

ObjectiveThe high fat diet to establish the animalmodel of nonalcoholic fatty liver and thorough research on non alcoholic fatty liver of traditional Chinesemedicine treatment provide the basis.Methods 70 male SD ratswere random ly divided into two groups，namely the normal group（n＝20），model group（n＝50）and normalgroup were divided to five groups，4 rats in each group；model group was divided for5 groupswith 10 rats in each group.The normal group was given normal diet，model group was given conventional high fat diet.In the fourth week，sixth weeks，eighth weeks，tenth weeks，Twelfth weeks respectively 1 normal grup and 1 model grup nre excuted.Observation of rat liver grossly，weighing liverwetweight calculated rat liver body ratio，and liverwere paraffin section and he staining and frozen sectionswith Sudan IIIstaining.Results From the beginning of the fourth week，rats in themodel group liver wetweight increased，normal rats liver wet and heavy difference，and there was significant difference in the sixth week，the tenth week and the twelfth week.From the sixth weekendmodel group liver index increased significantly differencewith normal liver index contrast group.Themicroscopic appearance of liver from four appeared mild fatty liver，and with the extension ofmodelmaking，increasing.Conclusion The conventional high fat diet（88%ordinary feed adding 10%lard oil and 2%cholesterol）made the animalmodel of nonalcoholic fatty liver.Aftermodeling the around the nonalcoholic fatty liver，and with the prolongation of time increasing.

Hyperlipidemia；nonalcoholic fatty liver；model

R965.1

A

1007－8517（2015）13－0014－04

2015.05.20）

文獻綜述

王保芹 （1989－），男，安徽中醫(yī)藥大學2014級研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病。