哈尼族驗(yàn)方 “莫那奇”對(duì)腦出血模型大鼠神經(jīng)缺損體征及腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的影響

褚 鑫胡曙華王國(guó)棟熊金富程鵬飛蔡恩麗*

1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省墨江縣縣委黨校醫(yī)務(wù)室，云南 墨江 654800

哈尼族驗(yàn)方 “莫那奇”對(duì)腦出血模型大鼠神經(jīng)缺損體征及腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的影響

褚 鑫1胡曙華2王國(guó)棟1熊金富1程鵬飛1蔡恩麗1*

1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省墨江縣縣委黨校醫(yī)務(wù)室，云南 墨江 654800

目的：探討哈尼族驗(yàn)方 “莫那奇”對(duì)大鼠腦出血 （ICH）后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 （BDNF）陽性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和莫那奇組各10只，以自體血注入法建立大鼠ICH模型，以Berderson評(píng)分法對(duì)其神經(jīng)缺損體征進(jìn)行評(píng)分，應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)干預(yù)后BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的變化。結(jié)果：與模型組比較，莫那奇組大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度恢復(fù)，腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。空白組和假手術(shù)組基本無陽性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論：哈尼族驗(yàn)方 “莫那奇”促進(jìn)神經(jīng)缺損體征恢復(fù)和腦組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的增加可能是其治療腦出血后神經(jīng)損傷的重要機(jī)制之一。

哈尼族；BDNF；腦出血；腦組織修復(fù)

腦出血（intra cerebral hemorrhage，ICH）是指原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)的非創(chuàng)傷性出血，是臨床常見的腦血管疾病。ICH后腦損傷的緩解和治療是臨床實(shí)踐中重要的環(huán)節(jié)［1］，在降低患者致殘率和死亡率、改善患者生活質(zhì)量方面起重要作用。哈尼族驗(yàn)方 “莫那奇”在長(zhǎng)期臨床治療ICH中效果顯著，本實(shí)驗(yàn)以ICH大鼠模型作為治療對(duì)象，探討 “莫那奇”對(duì)大鼠腦出血 （ICH）后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 （BDNF）陽性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用，以揭示其治療ICH的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年昆明種SD大鼠40只，雌雄各20只，體重在220～240g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證書號(hào)：SCXK（滇）2011-0004。隨機(jī)分為四組：正常組、假手術(shù)、模型組、莫那奇組各10只。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境2周，常規(guī)飼養(yǎng)，體重達(dá)到250～280g時(shí)開始造模；造模前禁食12h，禁水6h；實(shí)驗(yàn)中，剔除死亡和不合格者，及時(shí)追加動(dòng)物以補(bǔ)充模型。

1.2 儀器設(shè)備與試劑 腦立體定位儀 （深圳瑞沃德生命科技有限公司）；石蠟切片機(jī) （LEICA，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（LEICA，德國(guó)）；手術(shù)器械 （上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；乙醇 （成都化學(xué)試劑廠，分析純 AR）；水合氯醛（上海試劑公司，分析純AR），0.1 M PBS（NaCl 9g+ NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸餾水至1000ml）；0.1%DEPC溶液（lmlDEPC+999mlPBS）；4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2～7.6）（多聚甲醛40g+ 0.1%DEPC溶液至1000ml）；BDNF原位雜交試劑盒（武漢博士德公司）；莫那奇湯 （老虎刺皮、黑皮跌打、山皮條、滿山香、藤蕉、大荃麻、松節(jié)、楊梅皮、天紅地綠等各9g，濃度為1200g生藥/L）。

1.3 ICH模型的制備和篩選 手術(shù)器械消毒備用，參照并改進(jìn)Rosenberg等［2］報(bào)道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后，采用Berderson［3］評(píng)分法，篩選成功模型動(dòng)物。根據(jù)Berderson神經(jīng)體征評(píng)分法：輕抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：腦部病變對(duì)側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：上述體征陽性，向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)打圈 （呈追尾狀）。分?jǐn)?shù)在1分以上 （包括1分）即為造模成功。

1.4 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)方法 空白組：10只大鼠，不做任何手術(shù)處理，常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1m l，每日1次，連續(xù)3d。假手術(shù)組：10只大鼠，分別用10%水合氯醛（0.4m l/100g）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，術(shù)中微量注射器沿鉆孔進(jìn)針約6mm，留針約7min，緩慢出針，處理創(chuàng)面，清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3d。模型組：10只，造模后不治療，常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1m l，每日1次，連續(xù)3d。莫那奇組：每日按生藥4.5g/kg體重/d給予莫那奇湯灌胃，每日1次，連續(xù)3d。各組大鼠在造模3d后重新進(jìn)行Berderson神經(jīng)體征評(píng)分。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉，順序灌注生理鹽水和4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2～7.4）各約200ml，灌注完畢后在冰浴中快速開顱并取出完整腦，距注射針孔前后各約2mm冠狀切開，將標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.6 制作石蠟切片 固定腦組織30～40min后沖水2～3h，脫水透明（將腦組織依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇過夜、95%乙醇2h、無水乙醇Ⅰ0.5h、無水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min），浸蠟（將腦組織依次浸入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ各2h），包埋后切片 （片厚5μm）。將切片放入60℃烤箱2h。

1.7 原位雜交檢測(cè)BDNF 石蠟切片常規(guī)脫蠟，滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，后固定，預(yù)雜交，雜交，洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化過氧化物酶，DAB顯色，必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗，脫水，透明，封片。

1.8 圖像分析 利用病理圖像分析軟件，在400倍光鏡下，隨機(jī)選取每張切片ICH血腫周邊5個(gè)不同視野，陽性細(xì)胞呈褐色或棕黃色，區(qū)分各切片所選視野內(nèi)陽性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)用±s表示，各組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時(shí)選用LSD法，方差不齊時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Berderson神經(jīng)體征評(píng)分比較 莫那奇組、模型組大鼠均表現(xiàn)不同程度的出血對(duì)側(cè)偏癱，莫那奇組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。空白組和假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能異常。見表1。

表1 各組大鼠Berderson神經(jīng)體征評(píng)分的比較 （n=10，±s）

表1 各組大鼠Berderson神經(jīng)體征評(píng)分的比較 （n=10，±s）

注：莫那奇組與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05。

組別 莫那奇組 模型組 假手術(shù)組 空白組神經(jīng)體征評(píng)分0.8±0.63*1.3±0.82 0.0±0.0 0.0±0.0

2.2 各組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的比較 莫那奇組、模型組分別與空白組、假手術(shù)組進(jìn)行比較，BDNF陽性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，莫那奇組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。空白組和假手術(shù)組基本無陽性表達(dá)細(xì)胞。見表2。

表2 各組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的比較（n=10，±s）

注：莫那奇組與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，▲P＜0.01。

組別 莫那奇組 模型組 假手術(shù)組 空白組陽性細(xì)胞數(shù)18.5±3.44▲7.80±1.93 1.50±0.97 0.40±0.70

3 討論

腦出血是中老年人多發(fā)病種，起因復(fù)雜，病理機(jī)制尚不明確，并發(fā)癥和后遺癥多，其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率給病患生活帶來極大困擾，因此也是廣大醫(yī)務(wù)工作者和基礎(chǔ)科研的重點(diǎn)研究對(duì)象。

臨床上腦出血急性期多采用手術(shù)療法，如開顱清除血腫、降顱壓、穿刺抽吸血腫、血性腦液引流等，一般療法包括吸氧、控制血壓、降溫、防治并發(fā)癥等輔助措施，但老年人由于體質(zhì)弱、耐受差、術(shù)后易感染，不宜施行手術(shù)，因此尋找安全有效的療法對(duì)中老年患者十分必要。傳統(tǒng)醫(yī)藥治療腦出血有豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，能有效減輕出血后腦組織損傷程度，提高患者生活質(zhì)量，目前應(yīng)用較多的傳統(tǒng)方法多為中草藥制劑，如川芎嗪、羚角鉤藤湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯等［4］。

哈尼族醫(yī)藥作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，已有數(shù)千年的發(fā)展歷史，其以多樣的療法和顯著的療效，有力地保障了哈尼族的文明延續(xù)，備受哈尼人民尊重。墨江縣委黨校醫(yī)務(wù)室胡氏之 “莫那奇”，哈尼族用語，意為 “中風(fēng)、風(fēng)濕麻木很好的藥”。莫那奇由哈尼族民族民間草藥為主組成：老虎刺皮 （駱銘傲割阿孜）、黑皮跌打 （啊納呃積赤）、山皮條 （呃殼呃積）、滿山香 （約茅膩）、藤蕉（札柯倍都耶）、大荃麻 （和茄榪）、松節(jié) （托自阿尼）、楊梅皮 （昔切呃積）、天紅地綠 （咪呢秘尼）等 （括號(hào)內(nèi)藥名為哈尼用語）。主要功效為活血化瘀、行氣止痛、通經(jīng)活絡(luò)。其中天紅地綠、滿山香、藤焦等辛辣芳香，為健脾理氣之品，能行氣活血；黑皮跌打、楊梅皮、老虎刺皮、山皮條等有活血止血的功效。哈尼醫(yī)藥與中醫(yī)藥理論有許多相通和相似之處，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其研究提供了很好的契機(jī)。研究表明，腦出血后腦內(nèi)瘀血、水腫、血紅蛋白毒性、繼發(fā)性腦缺血等多種因素致使胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路激活，氧自由基增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［5］，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、保護(hù)和修復(fù)損傷的作用［6-7］。生理狀態(tài)下BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)較少，ICH出血灶周圍組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，BDNF表達(dá)上升，其受體TrkB與BDNF表達(dá)協(xié)同上調(diào)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF通過激活其受體TrkB，阻斷胞內(nèi)損傷因子對(duì)蛋白激酶C的失活，來防止神經(jīng)元發(fā)生變性、死亡［8］。石秋艷等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ICH后誘導(dǎo)BDNF蛋白表達(dá)，有利于對(duì)損傷NCs的保護(hù)和修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中，莫那奇湯組與對(duì)照組相比，大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度的恢復(fù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦出血病灶周圍組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量增加顯著，由此推斷，莫那奇湯促進(jìn)腦組織BDNF的表達(dá)，有利于損傷神經(jīng)元的保護(hù)和修復(fù)，可能是其治療腦出血的機(jī)制之一。

［1］皮志杰.腦出血的病因病理變化及治療進(jìn)展 ［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版），2009（05）：457-458.

［2］Gary A Rosenberg，S Mun-Bryce，M Wesley，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801.

［3］Bederson JB，Pitts LH，TsujiM.Ratmiddle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472.

［4］焦健，徐淑娜.羚羊鉤藤湯臨證加減治療高齡腦出血患者臨床研究［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2015（07）：21-23.

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［6］Melina LWillsom，Catriona Mcelnea，Jean Mariani，etal.BDNF increases homotypic olivocerebellar reinnervation and associated finemotor and cognitive skill［J］.Brain，2008，131（4）：1099-1112.

［7］Xing-Yun Song，F(xiàn)ang Li，F(xiàn)eng-He Zhang，et al.Peripherally-derived BDNF promotes regeneration of ascending sensory neurons after spinal cord injury［J］.Pl One，2008，3（3）：1707.

［8］周暉，毛萌.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)缺氧胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.華西醫(yī)大學(xué)報(bào)，2002，33（4）：573-576.

［9］石秋艷，何俊芳，孫惠芳.腦出血大鼠腦內(nèi)NGF和BDNF蛋白表達(dá)變化的研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010（07）：8-10.

The Intervention of the Neural Symptoms and the Counts of Brain-Derivedneurotrophic Factor Positive Expression Cells after Experimental Intracerebral Hemorrhage（ICH）in Rats Taken the“Monaqi”Prescription of Hani Nationality

CHU Xin1，HU Shuhua，WANG Guodong1，XIONG Jinfu2，CHENG Pengfei2，CAIEnli1*
1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.The Committee Party School Infirmary of Mojiang County in Pu'er City，Mojiang 654800，China

Objective To study the intervention of the neural symptoms and the counts of brain-derived neurotrophic factor positive expression cells after experimental intra cerebral hemorrhage（ICH）in rats taken the“Monaqi”prescription of Hani nationality. Methods 40 rats were random ly divided into normal control group，sham operated group，ICH model group and“Monaqi”group. With themethod of injecting autologous blood to produce the ICH model，the counts of brain-derived neurotrophic factor positive expression cells was detected by in situ hybridization.Results Compared with themodel set，the counts of the positive expression cells of brain-derived neurotrophic factor was increase obviously in the“Monaqi”set，and had the statistical significance（P＜0.01）. There were no expression of brain-derived neurotrophic factor in the normal control group and sham operated group basicly.Conclusion By taking the“Monaqi”prescription of Hani nationality to the ICH rats can promote the recovery of the brain tissues，and increase the counts of brain-derived neurotrophic factorpositive expression cellsmaybe one of the importantmechanisms.

Hani Nationality；Brain-derived Neurotrophic Factor；Intracerebral Hemorrhage；Recovery of the Brain Tissues

R29

A

1007-8517（2015）23-0003-02

2015.10.12）

云南白藥、云南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥教育創(chuàng)新基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：YB2014505）。

褚鑫 （1984-），男，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。

蔡恩麗 （1972-），女，教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床。