三葉木通中酚醇和酚醇苷的生物活性研究

關樹光 於文博 潘文君 修志儒

長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117

藥物研究

三葉木通中酚醇和酚醇苷的生物活性研究

關樹光 於文博 潘文君 修志儒

長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117

目的：研究三葉木通莖中的四種酚醇和兩種酚醇苷的抗氧化活性及抑制脂多糖誘導生成一氧化氮的活性。方法：通過對氧化自由基吸收能力（ORAC）熒光檢測法測定化合物的抗氧化活性。利用脂多糖（LPS）誘導小鼠單核細胞RAW267.4產生一氧化氮（NO）的含量和細胞增殖檢測法 （MTT法），確定化合物抑制NO生成的作用。結果：三葉木通中的酚醇及酚醇苷類化合物 （1～6）與陽性對照藥維生素C（Vitamin C）相比，具有很強的抗氧化活性，其中酚醇類化合物 （1～4）比酚醇苷類化合物 （5～6）的抗氧化活性更強；化合物（1～6）均沒有細胞毒作用；與陽性對照藥N-單甲基-L-精氨酸（L-NMMAa）相比，化合物（1～6）顯示了中等抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的活性。結論：三葉木通莖中四個酚醇類和兩個酚醇苷類化合物具有明顯的抗氧化活性和對LPS誘導RAW264.7細胞生成NO的中等抑制活性。

三葉木通；酚醇和酚醇苷；NO抑制活性；抗氧化活性

木通一詞最早見于 《藥性賦》，在我國乃至其他亞洲國家廣泛應用有近千年［1］。三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.是《中國藥典》收載木通藥材基源之一，具有祛心火、利尿、調經、催乳等功效，現代臨床常用于抗感染、利尿。

1 儀器與材料

1.1 儀器 RF-5301 PC熒光分光光度計（日本島津公司）；MCO-15AC培養箱（日本三洋公司）；MK3酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 藥材 三葉木通于2011年5月采集自江西省武寧縣九嶺山，經長春中醫藥大學藥學院姜大成教授鑒定為Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz，樣品保存于長春中醫藥大學（樣品編號：201108006）。

1.3 試藥 96孔板（Perkin Elmert生物科學公司）；水溶性維生素E（Trolox）（美國Aldrich化學試劑公司）；維生素C（百靈威科技有限公司）；熒光素鈉鹽（Sodium Fluorescein，SF）（美國Sigma公司）；2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）（美國Wako Pure化學公司）；脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）。

2 方法與結果

2.1 化合物的提取與分離 三葉木通干燥莖，水加熱提取，濾過，濾液減壓濃縮，濃縮液經D-101大孔樹脂柱層析，分別以水、20%乙醇洗脫。20%乙醇洗脫部分再經硅膠柱層析 （氯仿-甲醇4∶1～2∶1梯度洗脫），制備型高效液相純化（甲醇∶水=10∶90～15∶85），共獲得6個化合物。化合物（1～6）分別為4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲醇；赤式-1-苯-（4′-羥基-3′-甲氧基）-2-苯（4″-羥基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇）；蘇式-1-苯-（4′-羥基-3′-甲氧基）-2-苯-（4″-羥基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇；（7S，8S）-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3-丙三醇；2-（4-羥基-3-甲氧基苯）-乙醇1-β-D-葡萄糖苷；（7S，8S）-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3-丙三醇-2-β-D-葡萄糖苷。見圖1［2］。

2.2 一氧化氮（NO）抑制活性測定 酚醇和酚醇苷類化合物（1～6）對誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的抑制試驗是通過測定脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞產生NO的量完成［3］。RAW264.7巨噬細胞加入改良Eagle培養基（DMEM）［含100U/ml青霉素及100（g/ml鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）］中，于37℃，在5%CO2培養箱中傳代培養三代，取對數生長期細胞用于實驗。

圖1 化合物1-6的化學結構式

取對數生長期細胞于無酚紅的10%FBS-DMEM培養液中，調整細胞濃度為2×105/m l，接種于96孔板中繼續培養24h后，細胞用磷酸緩沖液（PBS）洗滌，更換新培養液，并加入4μg/ml LPS刺激細胞20h，收集細胞培養液，采用Griess法，通過測定反應生成的亞硝酸鹽含量的方法間接測定NO產生量。將180μl Griess試劑［0.1%N-（1 -萘基）乙二胺鹽酸鹽水溶液和1%磺胺5%磷酸溶液，體積比1∶1］加入每100μl經LPS和待測化合物處理過的96孔板細胞上清液中。上述實驗平行做三次。L-NMMAa（N -單甲基-L-精氨酸）作為陽性對照藥［4］。

化合物（1～6）對LPS誘導的RAW264.7細胞的細胞毒作用也按照文獻方法［5］進行測定，以避免細胞毒作用對化合物抑制iNOS的影響。

2.3 抗氧化能力指數（ORAC）測定 抗氧化能力指數測定應用了Cao等報道的稍改良的ORAC測定法［6-7］。170μl R-藻紅蛋白（R-PE）溶解于PBS并置于96孔板中，37℃預培養15min后，加入10μl空白對照PBS，陽性對照水溶性維生素E（Trolox）或化合物樣品，濃度為500、50、5、0.5、0.05μM，再加入20μl 2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）后開始反應，反應液終濃度分別為R-PE 4μg/ml、Trolox 2.5μM，AAPH 12mM。維生素C用做陰性對照。上述實驗平行三次。75min內，熒光（激發波長530nm，發射波長590nm）每5min記錄一次，結果按下式計算：

S=（0.5+f5/f0+f10/f0+f15/f0+···i···F65/ f0+f70/f0+f75/f0）×5

（f0是初始熒光；fi是時間i時的實測熒光）

［（ORAC值（M）=2.5×K×（S樣品-S空白）/（S維生素E-S空白）K是指樣品稀釋因子］

2.4 統計學方法 數據采用SPSS 11.0統計軟件進行處理，采用Student′s t、t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2.5 結果

2.5.1 抑制脂多糖誘導的NO產生活性 由表1可知，化合物（1～6）具有中等抑制LPS誘導產生NO的活性，其中化合物 （1～4）與化合物 （5～6）比較作用較明顯。且化合物 （1～6）均沒有細胞毒作用。

表1 化合物（1～6）對LPS誘導的RAW264.7細胞產生NO的抑制作用

2.5.2 抗氧化活性 通過ORAC法測定化合物的抗氧化活性，結果表明化合物 （1～6）均具有很強的抗氧化活性。見圖。

圖2 ORA法檢測維生素C和化合物1-6的抗氧化合物

3 討論

一氧化氮是一種很強的信號分子，存在于心血管系統、神經系統乃至全身，可以透過細胞膜并傳遞特定的信息或生物信號以調整細胞的活動，幫助機體完成特定的功能。NO可與超氧陰離子反應生成過氧化亞硝基陰離子，后者是強氧化劑，可造成細胞脂質過氧化、蛋白質酪氨酸硝基化、巰基氧化等，介導多種疾病的發生。三葉木通的酚醇及酚醇苷類化合物在體內外均有顯著藥理活性。

研究發現，三葉木通中的酚醇及酚醇苷類化合物 （1～ 6）通過抑制LPS誘導的RAW264.7細胞產生NO的生成，抑制炎癥反應。通過應用MTT法測定了化合物 （1～6）的細胞毒作用，以排除因化合物本身的細胞毒作用而干擾化合物對NO產生抑制活性的測定。結果表明所測化合物均沒有細胞毒作用，NO產生抑制活性結果可以直接反映被測化合物對LPS誘導的RAW264.7細胞產生NO的活性。同時，酚醇類化合物 （1～4）比酚醇苷類化合物 （5～6）具有更強的抗氧化活性。證實了三葉木通中提取的六種酚醇及酚醇苷類化合物具有抑制NO生成的作用并對由NO誘發的多種疾病具有顯著的防治作用，也為酚醇及酚醇苷類化合物提供了藥效物質基礎；為提升藥材飲片、中成藥的質量控制提供了科學依據。

［1］梁永紅.三葉木通資源和質量分析研究 ［D］.北京：北京中醫藥大學，2006.

［2］關樹光，於文博，關樹宏.三葉木通中酚醇及酚醇苷類化學成分的研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（4）：905-906.

［3］Han AR，Kang YJ，Windono T，etal.A new antifouling hexapeptide from a Palauan sponge，Haliclona sp［J］.Journal of Natural Products，2006；69：719 -721.

［4］李巖，鄺棗園，李明，等.黃芩苷對脂多糖誘導巨噬細胞一氧化氮和一氧化氮合酶表達的影響［J］.廣東醫學，2010，31（6）：675-677.

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［6］Cao G，Prior RL.Measurement of oxygen radical absorbance capacity in biological samples［J］.Methods Enzymol.1999，299：50-52.

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R285.5

A

1007-8517（2015）23-0012-02

2015.08.28）

吉林省中醫藥管理局中醫藥科技項目（2014-ZC1）。

關樹光 （1980-），女，講師。主要從事中藥有效成分的研究。