五倍子單寧脂質體的制備及質量評價

吳曉霞,李建科

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

五倍子單寧脂質體的制備及質量評價

吳曉霞,李建科*

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

以超聲波輔助溶劑提取法提取五倍子單寧,逆相蒸發法制備五倍子單寧脂質體,研究制備脂質體最佳工藝,并對在優化條件下制備的脂質體進行理化性質評價。結果表明優化條件為:卵磷脂與膽固醇的質量比(SPC/CH)為2∶1、有機相與水相體積比(O/A)為6∶1、緩沖液pH6.5。在此條件下質量濃度為1mg/mL的五倍子單寧溶液制備的五倍子單寧脂質體包封率為72.26%。結構描述:有效粒徑為(79.39±11.62)nm,Zeta電位為-44.7mV,穩定性:4℃條件下儲存穩定性良好。逆相蒸發法制備脂質體工藝簡單可行,包封率高,粒度均勻,穩定性好,可用于五倍子單寧脂質體的制備。

五倍子單寧,脂質體,逆相蒸發法,質量評價

五倍子(GallaChinensis),又稱文蛤、百蟲倉、木附子,是由五倍子蚜蟲寄生在漆樹科植物鹽膚木、青麩楊或紅麩楊葉上形成的蟲癭[1],又稱棓子。在我國,主產區集中在貴州、四川、湖北、湖南、陜西、云南等六省,這些省份的五倍子產量約占全國總產量的90 %以上[2]。五倍子單寧是五倍子的主要功能成分和含量最多的成分,五倍子單寧含量可達70%以上[3]。按照單寧的化學結構特征,單寧可分為如下:可水解單寧,縮合單寧和復合單寧[4],實驗所用單寧為水解單寧,是由沒食子酸、雙倍酸與葡萄糖結合以甙或酯的形式形成的復雜混合物[5]。五倍子單寧不僅具有抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用,還具有不同程度的抗過敏、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、調節免疫等多種生物活性[3]。

脂質體是磷脂分散在水中自然形成多層囊泡,每層均為雙分子層,囊泡中央和各層之間被水相隔開[6]。脂質體是由磷脂為膜材料及附加劑組成[7]。脂質體具有類似細胞膜的結構,內部含著一定體積的水溶液。脂質體的制備方法有很多種,主要有薄膜法、逆相蒸發法、注入法、凍融法、服乳法、pH梯度法和冷凍干燥法等[8]。逆相蒸發法適合包裹水溶性藥物、大分子生物活性物質如各種抗生素、胰島素、免疫球蛋白、堿性磷脂酶和核酸等。

用脂質體包裹藥物可使藥物選擇性地分布于人體內某些組織和器官,避免藥物氧化、降解和破壞,可增加藥物通過細胞膜的能力,起到增強療效的作用[9]。目前,關于多酚類物質制備脂質體的研究有石榴皮多酚脂質體[10]、茶多酚脂質體[10]等的研究,但沒有關于五倍子單寧脂質體的研究,而五倍子在臨床上有很重要的功效。因此,對五倍子單寧脂質體的研究具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五倍子單寧純化物 實驗室制備;五倍子單寧標品、大豆卵磷脂(SPC,soybean phospholipids)、膽固醇(CH,cholesterol) 西安市晶博生物技術有限公司;氯仿及其余試劑 為國產分析純。

光學顯微鏡、紫外可見分光光度計(TU-1 810) 北京普析通用儀器有限責任公司;超高速低溫離心機(3k30) 美國Sigma公司;精密微量移液器(100～1000μL) 德國Eppendorf;旋轉蒸發器(RE-52AA) 上海亞榮生化儀器廠;激光粒度和Zeta電位儀(NANO-ZS) 英國Malvern公司;精密pH計(PHS-3C):上海精密科學儀器有限公司;漩渦混合器(XW-80A) 海門市其林貝爾儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五倍子單寧的提取及純化 為陜西師范大學食品工程與營養科學學院營養與衛生實驗室制備[11-12]。

1.2.2 五倍子單寧脂質體的制備 參考文獻[13-15]。

1.2.2.1 五倍子單寧磷酸鹽緩沖溶液的配制 稱取100mg的五倍子單寧純化物,用pH6.5磷酸緩沖液定容至100mL的棕色容量瓶中,即得質量濃度為1mg/mL的五倍子單寧磷酸鹽緩沖溶液[10]。

1.2.2.2 五倍子單寧脂質體的制備工藝 采用逆相蒸發法制備五倍子單寧脂質體,研究在大豆卵磷脂和膽固醇的質量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1;有機相和水相的體積比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1;磷酸鹽緩沖液的pH4.5、5.5、6.5、7.5、8.5時,以五倍子單寧脂質體的包封率為考察指標確定最佳制備工藝。

1.2.3 五倍子單寧脂質體包封率測定方法

1.2.3.1 標準曲線的建立 精密配制濃度分別為0、10、20、30、40、50μg/mL系列五倍子單寧溶液;以雙蒸水為空白對照,在最佳波長處用紫外可見分光光度計測定吸光度值。以五倍子單寧濃度為橫坐標,吸光度A值為縱坐標,繪制標準曲線,并進行回歸分析。

1.2.3.2 五倍子單寧脂質體包封率的測定方法 參考文獻[16-17]，采用高速冷凍離心法測定包封率:取五倍子單寧脂質體及空白脂質體溶液各3mL于離心管中,分別加入乙酸乙酯3mL破乳,旋渦3min;于15000r/min轉速、4℃溫度條件下離心30min,取上清液1mL至25mL的容量瓶中,加入蒸餾水定容;空白脂質體作為對照,在最佳波長下測定吸光度;代入回歸方程,得到總量Ct。

取五倍子單寧脂質體及空白脂質體溶液各3mL于離心管中,直接在15000r/min轉速、4℃溫度條件下離心30min,取上清液1mL至25mL的容量瓶中,空白脂質體作為對照,在最佳波長下測定吸光度。代入回歸方程,得到未被包入即游離的脂質體量Cf。

得到總量和游離脂質體量,包封率便可求出:

1.2.4 脂質體的質量評價 鑒于脂質體在各個領域的應用原理,一般采用3個參數來評價脂質體的性質:脂質體的大小、包封率和脂質體的穩定性[6]。

脂質體的大小:采用掃描電鏡、激光散射法或激光掃描法測定。

包封率(%)=(脂質體中包封的藥物/脂質體中藥物總量)×100。

脂質體穩定性:也是衡量脂質體特性的主要指標之一。它反映了脂質體溶液包封率隨時間變化的情況。主要用滲漏率表示,滲漏率(%)=(放置前介質中藥物量-放置后介質中的藥量)/制劑中藥量×100。

1.2.4.1 五倍子單寧脂質體外觀檢驗 光學顯微鏡下觀察:將五倍子單寧脂質體溶液稀釋100倍后,滴1滴于載玻片上,在光學顯微鏡下觀察脂質體外觀形態并拍照記錄。

1.2.4.2 五倍子單寧脂質體粒度測定及Zeta電位測定 將五倍子單寧脂質體用雙蒸水稀釋100倍,再用水系0.45μm濾膜過濾,用激光粒度和Zeta電位儀測定脂質體的粒徑大小、粒徑分布及電勢大小。

1.2.4.3 五倍子單寧穩定性研究 脂質體屬于膠體分散體系,是熱力學不穩定體系。它在存放過程中會發生物理、化學、生物等方面的變化,從而影響其穩定性能。本實驗在 4℃與常溫條件下分別將五倍子單寧脂質體放置0、10、20、30、40、50和60d,按1.2.2.3方法測定包封率(Y)的變化。

1.2.5 數據處理 采用DPS3.01數據處理軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 五倍子單寧脂質體包封率測定

2.1.1 五倍子單寧溶液及空白脂質體波長掃描 對空白脂質體和五倍子單寧溶液分別在190～600nm處進行全波長掃描。波長掃描結果如圖所示:

圖1 空白脂質體波長掃描結果Fig.1 Scanning spectra of blank liposome

圖2 五倍子單寧溶液波長掃描結果Fig.2 Scanning spectra of gallnut tannins

由圖1、圖2可知,空白脂質體在194nm左右有吸收峰,而五倍子單寧有兩個大的吸收峰,分別是213nm和276nm。考慮到空白脂質體在213nm處也有較大吸收值,而在276nm處基本無吸收值,因此選擇276nm為測量五倍子單寧含量的最佳波長。

2.1.2 五倍子單寧溶液標準曲線的建立 五倍子單寧溶液標準曲線如圖3所示,以五倍子單寧溶液的質量濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光度值A為縱坐標,得到線性回歸方程為y=0.0291x-0.001,相關系數R2=0.9993,五倍子單寧溶液質量濃度在0～50μg/mL范圍內與吸光值有良好的線性關系。

圖3 五倍子單寧標準曲線Fig.3 Standard curve of gallnut tannins

2.2 五倍子單寧脂質體制備的單因素實驗結果

2.2.1 大豆卵磷脂和膽固醇的質量比對五倍子單寧脂質體包封率的影響 有機相和水相的體積比5∶1、磷酸鹽緩沖液的pH6.5,考察大豆卵磷脂和膽固醇的不同質量比對五倍子單寧脂質體包封率的影響情況。

圖4 大豆卵磷脂與膽固醇的質量比 對脂質體包封率的影響Fig.4 Effect of the ratio of soybean phospholipids to choleste on encapsulation

由圖4可見,大豆卵磷脂和膽固醇的質量比對包封率有顯著的影響。隨著卵磷脂比例的增大,包封率也隨著增大,這是因為作為類脂膜重要組成部分的膽固醇,它具有調節膜流動性和穩定磷脂雙分子層的作用,當比例過大時,包封率也隨之降低,這是因為組成脂質體的膽固醇量太少,膜難以形成且不牢固。所以,在大豆卵磷脂和膽固醇的質量比為2∶1時,它們之間有良好的協同作用,包封率達到最大68.94%。

2.2.2 有機相和水相的體積比對五倍子單寧脂質體包封率的影響 磷酸鹽緩沖液的pH6.5和大豆卵磷脂與膽固醇的質量比2∶1,考察有機相/水相不同體積比對五倍子單寧脂質體包封率的影響情況。

圖5 有機相/水相的體積比對脂質體包封率的影響Fig.5 Effect of the ratio of oil phase to aqueous phase on encapsulation

由圖5可見,五倍子單寧脂質體的包封率隨著有機相/水相的體積比增加,包封率呈現增加的趨勢。當有機相/水相的體積比值增加到6∶1時,包封率達到最大72.26%。

2.2.3 磷酸緩沖液pH對五倍子單寧脂質體包封率的影響 大豆卵磷脂與膽固醇的質量比2∶1與有機相/水相的體積比6∶1,考察不同pH條件下對五倍子單寧脂質體包封率的影響情況。

圖6 磷酸鹽緩沖液的pH對脂質體包封率的影響Fig.6 Effect of the pH of phosphate buffer solution on encapsulation

由圖6可見,五倍子單寧脂質體的包封率隨著磷酸鹽緩沖液pH的增加而增加,當pH增加到6.5時,達到最大,之后隨著磷酸鹽緩沖液pH的增加包封率反而變小。因此,本實驗中磷酸鹽緩沖液最佳的pH為6.5。

制備五倍子單寧脂質體的最佳條件為:大豆卵磷脂與膽固醇的質量比為2∶1,有機相/水相的體積為6∶1,磷酸鹽緩沖液的pH為6.5。在此條件下制備的五倍子單寧脂質體的包封率達72.26%。

2.3 五倍子單寧脂質體質量評價

肉眼觀察下五倍子單寧純化物呈淡黃色粉狀,五倍子單寧磷酸鹽緩沖液為淡黃色,脂質體溶液為乳白色乳濁液。

2.3.1 五倍子單寧脂質體的顯微形態結構 圖7為五倍子單寧脂質體的光學顯微鏡照片。從圖7中可知,脂質體呈橢球形和圓球狀,分布均勻。

圖7 光學顯微鏡下五倍子單寧脂質體圖片(×40)Fig.7 Optical microscope picture of gallnut tannins liposome(×40)

2.3.2 五倍子單寧脂質體粒度測定及Zeta電位測定 五倍子單寧脂質體經激光粒度和Zeta電位儀測定后,粒徑大小、分布及電荷性質分別見圖8和圖9。

圖8 五倍子單寧脂質體粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of gallnut tannins liposome

圖9 五倍子單寧脂質體Zeta 電位Fig.9 Zeta potential of gallnut tannins liposome

由圖8可知,五倍子單寧脂質體的粒徑呈正態分布,有效粒徑為(79.39±11.62)nm,分散系數(Pdi)為0.407,說明粒徑分布較均勻。

由圖9可知,五倍子單寧脂質體電位為-44.7mv,此電位處于-30～-50mv范圍內,說明該脂質體表面帶負電荷,且體系比較穩定。

2.3.3 五倍子單寧脂質體穩定性 以時間為橫坐標,包封率為縱坐標,繪圖得五倍子單寧脂質體穩定性隨時間的變化結果(圖10)。

圖10 五倍子單寧脂質體穩定性曲線Fig.10 Leakage rate curve of gallnut tannins and its liposome

由圖10可知,五倍子單寧脂質體在4 ℃條件下儲存穩定性良好,前20d包封率基本沒有變化,也就是說,脂質體中的五倍子單寧在儲存的過程中基本沒有滲漏,隨著時間的延長,包封率呈緩慢下降趨勢,60d之內,包封率共下降20.05%,而外觀上脂質體溶液也基本無絮凝和沉淀現象。但在常溫下放置的脂質體包封率逐漸下降,并出現了不同程度的絮凝和沉淀,而且略有發霉現象,60d后被包裹的五倍子單寧已基本完全滲漏,因此五倍子單寧脂質體宜在4℃條件下儲存。

3 結論

逆相蒸發法制備五倍子單寧脂質體簡單可行,最佳工藝配方為:SPC/CH為2∶1,O/A值為6∶1,緩沖液pH為6.5。在此條件下質量濃度為1mg/mL的五倍子單寧溶液制備的五倍子單寧脂質體包封率為72.26%。

肉眼觀察下五倍子單寧呈淡黃色粉狀;五倍子單寧磷酸鹽緩沖液為淡黃色;脂質體溶液呈乳白色。從五倍子單寧脂質體的光學顯微電鏡可知,脂質體呈橢球形和圓球狀,分布均勻。五倍子單寧脂質體的粒徑呈正態分布,有效粒徑為(79.39±11.62)nm,分散系數(Pdi)為0.407,粒徑分布較均勻。五倍子單寧脂質體電位為-44.7mv,表面帶負電荷,體系比較穩定。五倍子單寧脂質體適宜的保存溫度為4℃。

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Preparation of gallnut tannins liposome and its quality evaluation

WU Xiao-xia,LI Jian-ke*

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Ultrasonic solvent extraction was used to eatarct the tannins in gallnut,and reverse-phase evaluation was used to prepare liposomes of gallnut tannins.The best technology was obtained and its physical and chemical properties were evaluated. The results showed that when the SPC/CH was 2∶1,the O/A was 6∶1,and the pH was 6.5,the entrapment efficiency of liposomes prepared by gallnut tannins was 72.26%,the effective diameter was(79.39±11.62)nm and the zeta potential was-44.7 mV,the favorable storage temperature was 4℃. Preparation process of liposome using reverse-phase evaporation was simple and feasible,high encapsulation efficiency,particle size uniformity,stability and can be used for preparation of gallnut tannins liposome.

gallnut tannins;liposomes;reverse-phase evaporation;quality evaluation

2014-03-21

吳曉霞(1982-)，女，在讀博士，實驗師，研究方向：食品營養與安全。

*通訊作者:李建科(1960-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與天然產物分離鑒定。

國家自然科學基金(31301598)；陜西省自然科學基金(2012JQ3014)；陜西師范大學中央高校基本科研項目(GK 201304007)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.006