超聲波嫩化處理對淘汰蛋鴨中鈣激酶活性影響的研究

秦衛(wèi)東，馬利華，陳學紅，王嘉俊

(徐州工程學院食品工程學院,江蘇徐州 221000)

超聲波嫩化處理對淘汰蛋鴨中鈣激酶活性影響的研究

秦衛(wèi)東，馬利華，陳學紅，王嘉俊

(徐州工程學院食品工程學院,江蘇徐州 221000)

采用不同功率及不同處理時間研究了超聲波嫩化淘汰蛋鴨胸肉的效果。結果表明:超聲波處理可以提高鈣激活酶的活性,通過鈣激活酶對肌原纖維蛋白質的水解作用降低肌肉的剪切力。超聲波功率及超聲波處理時間是決定嫩化效果的兩個重要因素。淘汰蛋鴨胸肉最適的超聲波嫩化條件分別為 300W功率、15min處理時間。相關分析證實鈣激活酶活性與肌肉剪切力之間呈現(xiàn)負相關(R2>0.76)。

淘汰蛋鴨,超聲波,嫩化,鈣激活酶

嫩度是肉類產(chǎn)品的一個重要質量指標,決定肉類嫩度的主要是肌原纖維蛋白和結締組織,其中結締組織對嫩度的影響取決于其含量、類型及交聯(lián)程度,特別是結締組織的交聯(lián)程度隨動物年齡的增大,從而年老動物的肉質較年輕者韌性更大。阿部等人[1]比較了2個月的仔雞和淘汰蛋雞的肉質,確認淘汰蛋雞雞腿和雞胸肉的硬度分別比仔雞大29.4%和39.5%,兩部位的總膠原蛋白含量分別高于仔雞,但熱溶性膠原蛋白比例卻低于仔雞。Northcuttt等人[2]指出:仔雞雞胸肉的Warner-Bratzler剪切力仔雞年齡的增加而增加。徐幸蓮等人[3]證實了肉雞和淘汰蛋雞的差別,發(fā)現(xiàn)淘汰蛋雞肌肉的持水功能比肉雞肌肉低,但剪切力顯著地高。因此,淘汰蛋雞在食用或利用之前必須進行嫩化處理。

超聲波處理是肉類嫩化的一種新技術,它以兩種方式作用于肉類:一是破壞肌肉細胞的完整性,二是增強酶促反應[4]。已經(jīng)報導了超聲波可以引起肌肉肌節(jié)的擴展[5-6]、肌原纖維的崩潰和破碎[6-8]、Z-線區(qū)域微結構的改變[6,9-10]。但未見超聲波處理對肉類內源酶,特別是鈣激活酶(calpain)活性影響的報導,而肉類的嫩化過程實質上是依賴于如pH、離子強度等物理化學條件的酶促反應,肌原纖維和肌原纖維相關蛋白質的水解作用通過弱化肌原纖維內和肌原纖維間的鍵而使肉類嫩化[11]。一系列的研究表明,鈣依賴性蛋白酶對于肉類的嫩化是必不可少的[12-15]。鈣激活酶催化脂原纖維的降解而使肉的嫩度增大。本研究的目的是探討超聲波嫩化過程中鈣激活酶活性及鴨肉剪切力的變化,確定鈣激活酶活性與鴨肉剪切力的關系,為超聲波嫩化技術提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淘汰蛋鴨(20個月齡)由徐州惠農鴨業(yè)有限公司提供。蛋鴨宰殺后,取胸肉剔除可見脂肪和結締組織,實驗前貯藏于-18℃。

Tris、β-巰基乙醇、酪蛋白、EDTA、三氯乙酸 Sigma公司產(chǎn)品；其余化學試劑 為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

超聲波細胞粉碎儀 BILON96-Ⅱ型,上海比朗儀器有限公司；勻漿機 ZW-800G,溫州維科生物設備有限公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma 3-30K；分光光度計 UV-2600,日本Shimadzu公司；嫩度計:C-LM3B 東北農業(yè)大學工程學院。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波處理 鴨胸肉解凍后,放入塑料袋中,排除空氣后密封。將塑料袋放入加水的燒杯中,置于超聲波細胞粉碎儀中,將超聲波探頭(Φ10mm)插入燒杯中,避免探頭與塑料袋接觸。改變超聲波功率或超聲波處理時間,嫩化鴨胸肉。

1.2.2 鈣激活酶的提取 按照Koomaraie[16]描述的程序提取鈣激活酶。簡要地,用3倍體積的含20 mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巰基乙醇、pH7.5的冰冷緩沖液將鴨肉組織用勻漿機進行勻漿處理。勻漿液在28000×g離心2 h,上清液用四層的粗棉布和玻璃棉過濾后,將pH調整到7.5,經(jīng)透析平衡緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巰基乙醇,pH7.5)透析20h。105000×g離心1h后,立刻上柱(DEAE-Sephacel,流速150mL/h)純化。用5倍的平衡緩沖液沖洗柱子,以除去未結合的蛋白質。用含0～400mmol/L NaCl 的平衡緩沖液梯度洗脫(每批350mL)。

1.2.3 鈣激活酶活性的測定 以酪蛋白作為底物測定鈣激活酶的活性[16]。取反應溶液(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巰基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,5g/mL 酪蛋白,pH7.5)3mL,加入1mL被分離的稀釋后的該蛋白酶粗酶液,空白為3mL反應溶劑(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巰基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,pH7.5),加入1mL緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA,pH7.0,1mol/L的醋酸調節(jié))；對照組為3mL反應溶液,加入1mL變性酶液,一般用加熱法,將酶液在100攝氏度沸水浴中加熱5min,上述各反應的總體積均為4mL。反應在室溫下進行了30min后,加入4mL的5%的TCA終止反應,TCA溶液的最終濃度為2.5%。然后將反應液離心(28000×g,30min),測定上清液的吸光值。

一個酶活性單位被定義為在標準實驗條件下30℃ 30min內在280nm下的吸光度增加1.0單位所需的酶的數(shù)量。

1.2.4 剪切力的測定 取適量鴨肉在85℃加熱至中心溫度達到70℃并保持30min,取出迅速冷至室溫,用吸水紙吸干表面水分后,用直徑1cm的空心取樣器順著肌纖維方向取樣,然后在嫩度計上測定其剪切力值。每個處理樣測定3次,求平均值。

2 結果與分析

2.1 超聲波功率對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響

不同功率的超聲波功率應用于鴨肉嫩化處理的結果如圖1所示。

圖1 超聲波功率對鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的影響Fig.1 Effect of ultrasound powers on the shear force and calpain activity in duck meat

從圖1可以看出:在300W以內的范圍內,隨著超聲波功率的增大,鴨肉中鈣激活酶活性急劇升高,而肌肉的剪切力幾乎直線下降。繼續(xù)增大功率至400W,酶活性下降,肌肉的剪切力變大。這一結果與李正英等人報導的超聲波嫩化羊肉的研究結果[17]相似。他們發(fā)現(xiàn):剪切力隨超聲波功率的增大而快速降低,當超聲波功率達到3.0W/cm2后,繼續(xù)增加超聲波功率時剪切力變化不大。

2.2 超聲波處理時間對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響

超聲波時間對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響表現(xiàn)出與超聲波功率相似的變化。即在5～15min范圍內,鈣激活酶活性急劇增大,剪切力直線下降,在15～25min范圍內鈣激活酶活性下降,剪切力升高。Jayasooriya等人[18]報導了在0～60s超聲波處理時牛肉的剪切力有很大程度的下降,但進一步延長處理時間,剪切力無顯著變化。Smith等人[19]也曾發(fā)現(xiàn),超聲波處理4min可增加肉類的嫩度,但處理時間延長至8～16min時肉類的嫩度反而降低。本研究的結果與上述結論基本一致。

圖2 超聲波處理時間對鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的影響Fig.2 Effect of ultrasound times on the shear force and calpain activity in duck meat

2.3 鴨肉中鈣激活酶活性與肌肉剪切力的相關分析

對不同超聲波功率嫩化及不同超聲波時間嫩化鴨肉后肌肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力之間進行相關分析,結果見圖3和圖4。

圖3 不同超聲波功率嫩化時鴨肉剪切力 與鈣激活酶活性的關系Fig.3 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound powers

圖4 不同超聲波處理時間嫩化時鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的關系Fig.4 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound treating times

由圖3和圖4可知:超聲波嫩化期間,肌肉中鈣激活酶活性與肌肉的剪切力呈現(xiàn)負相關(R2>0.76)。即隨著鈣激活酶活性的增大,肌肉的剪切力存在下降的趨勢。

3 討論

3.1 鴨肉的超聲波嫩化

超聲波嫩化作用一方面是通過超聲波空穴現(xiàn)象對肌肉組織產(chǎn)生物理損害,另一方面則是在損害或弱化肌肉組織的同時導致內源酶的激活而促進酶解作用[4]。

在較低的超聲波功率(≤300W)或較短的處理時間(5～15min)范圍內,隨著超聲波功率的增大,產(chǎn)生的空穴效應對肌肉組織的物理作用增強,有利于鈣離子從細胞結構中釋放出來,從而激活鈣激活酶。Got等人[5]和Jayasooriya等人[18]均觀察到超聲波處理后肌肉的pH升高,并認為這是由于肌肉細胞中離子釋放出的緣故。Lee等人[20]也認為用焦磷酸鈉和氯化鈉注射提高了pH,加速了鈣激活酶的活性,從而改善了肉嫩度。Got等人[5]確認,超聲波處理后,肌纖維間的空間內游離Ca2+增加30%。Koohmaraie等人[21]指出:肌原纖維小片化過程是由Ca2+調解的,當肌肉切片在用含螯合劑(EDTA或EGTA)的緩沖液處理時未觀察到肌原纖維小片化指數(shù)的改變,而當在肌肉切片用含CaCl2的緩沖液處理時肌原纖維小片化指數(shù)明顯加速。而當肌肉切片單獨用普通緩沖液處理時,肌原纖維小片化指數(shù)的增加量遠小于未處理的對照肌肉樣品。他們認為這種肌原纖維小片化指數(shù)的差異可能是由于大容量的緩沖液稀釋細胞內Ca2+的濃度。Pohlman等人[22]指出:超聲波作用于肉類可以促進增加鈣離子對鈣激活酶的有效性。本實驗中發(fā)現(xiàn)隨著超聲波處理的進行,肌肉中鈣激活酶活性增大,從而肌肉的剪切力變小。這一結果與上述研究和發(fā)現(xiàn)相一致。但當進一步加大超聲波處理(功率超過300W或時間大于15min)時,鈣激活酶的活性下降,肌肉剪切力增大。這是因為在超聲波作用的同時也會產(chǎn)生一定的熱量[7,18]。Jayasooriya等人[18]確認超聲波處理可能導致15～30℃的溫度升高。這種熱效應會使肌肉表面產(chǎn)生部分蒸煮[6]。肌肉表面的蒸煮將會導致表面蛋白質的變性,不利于Ca2+的釋放,從而鈣激活酶的活性減弱,肌肉硬度增大。或者,由于鈣激活酶的最適溫度為25℃左右[23],當溫度升高后,鈣激活酶的活性受到抑制。

3.2 鈣激活酶活性與肉類嫩度

人們普遍認為肉的嫩化過程本質上是酶促反應并依賴于pH、離子強度等物理化學條件。肌原纖維和與肌原纖維相關蛋白質的水解通過弱化肌原纖維內和肌原纖維間的鍵而使肉嫩化。盡管肌肉中的內源酶包括組織蛋白酶、蛋白酶體和鈣激活酶三種酶,但研究表明鈣激活酶對肉類的嫩化是至關重要的[11,24]。

高橋[23]認為,動物死亡后,肌漿中的Ca2+濃度增大2000倍,此時由Ca2+直接作用導致肌原纖維和中間纖維的非酶促脆弱化而使肌肉弱化,從而提出了肉類嫩化的“非酶鈣理論”。但是,許多研究都證實了酶的作用[12-15]。Pohlman等人[22]也確認:超聲波作用于肉類可以促進增加Ca2+對鈣激活酶的有效性。Geesink等人[25]則指出,Ca2+濃度與肌原纖維小片化指數(shù)(myofibrillar fragmentation index,MFI)顯著相關,而肌肉的嫩化與肌鈣蛋白-T的降解顯著相關。由于肌鈣蛋白-T是鈣激活酶的底物,因此,其降解過程不是通過Ca2+的直接作用,而是鈣激活酶作用的結果。本實驗用超聲波處理得出的結果也表明肌肉的嫩化與鈣激活酶呈負相關(R2>0.76),支持了肉類嫩化的酶促機理。

4 結論

超聲波處理可以激活鴨肉中鈣激活酶活性從而降低肌肉的剪切力。最適的超聲波處理條件為 300W功率、15min處理時間。

利用不同功率的超聲波及不同超聲波處理時間嫩化鴨肉的結果都顯示出鈣激活酶與肌肉剪切力之間呈現(xiàn)一定的負相關(R2>0.76)。

超聲波處理能夠激活鴨肉中的鈣激活酶,對鴨肉的嫩化具有促進機理。

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Study on effect of ultrasound treatment on calpain activityof spent laying duck muscles

QIN Wei-dong,MA Li-hua,CHEN Xue-hong,WANG Jia-jun

(Food Engineering School of Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221000,China)

The effect of ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were studied in different powers and ultrasound treatment times. The results indicated that activity of calpain in the pectoralis muscle was increased by the ultrasound treatment and proteolysis of myofibrillar by calpain reduced the shear force of the muscle. Two important factors were the ultrasound power and ultrasound treatment time in determination of the tendered effect. The optimum conditions for ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were 300W of power and 15min of the treatment time,respectively. The results of correlation analysis demonstrated that there were negative correlation(R2>0.76)between activity of calpain and the shear force of the muscle.

spent laying duck;ultrasound;tenderization;calpain

2014-05-04

秦衛(wèi)東(1961-)，男，本科，教授，研究方向：畜禽科學與加工。

國家富民強縣項目(BN2011209)。

TS253.1

A

1002-0306(2015)03-0078-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.007