基于SternVolmer與Tachiya模型分析牛血清白蛋白與花青素的相互作用

宋蘭蘭,周 瑞,景 浩

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

宋蘭蘭,周 瑞,景 浩*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

本文采用了熒光光譜、同步熒光光譜和紫外可見光譜的方法,研究了牛血清白蛋白與花青素在不同溫度(25、30、35℃)水體系中相互作用的光譜學特征,按照Stern-Volmer和Tachiya模型分析熒光光譜數據,獲得了二者反應的熱力學參數和結合參數(結合常數Ka、結合位點數n),進一步分析所得結合參數的差異。結果表明,花青素對牛血清白蛋白內源熒光有猝滅作用且屬于靜態猝滅。根據熱力學參數ΔH、ΔS的數值確定它們之間的作用力主要是靜電引力。同步熒光光譜顯示花青素的加入引起色氨酸熒光峰波長發生藍移,表明二者結合位點更接近于色氨酸殘基。根據Stern-Volmer得出的Ka隨溫度的升高而降低、n卻不受溫度的影響,由Tachiya得出的Ka、n均會隨溫度的升高而增大。由此可知,Stern-Volmer獲得的結合位點數幾乎不隨著溫度變化而變化,但由Tachiya得到的實際結合位點數隨溫度的升高而增大,Tachiya模型得到的結果更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。

花青素,牛血清白蛋白,Tachiya模型,Stern-Volmer模型,相互作用

花青素(Anthocyanin,ACN)是由一個3碳雜環(C環)連接兩個芳香環(A和B環)構成的C6-C3-C6碳骨架母核結構(圖1)。由于B環各碳位上取代基的不同,可將花青素歸為6類,即飛燕草色素、天竺葵色素、錦葵色素、矢車菊色素、芍藥色素和牽牛花色素,其中矢車菊素在自然界中分布最廣[1]。ACN的活潑酚羥基很容易被氧化成醌,因此穩定性較差[2]。ACN與乳清蛋白相互作用可使ACN的降解率明顯降低[3]。因此ACN與蛋白分子的相互作用,可以降低自身氧化過程并提高穩定性。

圖1 花青素基本結構 Fig.1 Chemical structures of anthocyanin

采用熒光光譜法研究BSA與ACN結合的相互作用是基于BSA中三個發射熒光氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的最大波長分別為348,303,282nm。根據實驗過程中ACN對BSA熒光光譜的變化,分析得到的熒光強度、發射峰特征、能量轉移等指標。通過理論模型對這些指標參數的分析,計算得到結合常數、結合位點數、結合距離、作用力類型等信息,從而闡明生物大分子與小分子相互作用的方式[4]。

Stern-Volmer和Tachiya都是用于計算結合常數(Ka)和結合位點數(n)的常用理論模型,但所得參數值有可能出現偏差。分別使用這兩種模型計算了BSA與金絲桃苷相互作用的n,發現Stern-Volmer計算的n值與溫度有關,而Tachiya得到的n值卻與溫度無關[5]。本文根據這兩個公式的理論基礎,在水溶液中利用熒光光譜、紫外吸收光譜研究了不同溫度(25、30、35℃)時,BSA與ACN之間相互作用的光譜學參數,以期為相關研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白(BSA,Albumin Bovine V)第五組分純度大于98%,分子量67200u,AMRESCO公司。篤斯越桔花青素(ACN,anthocyanin)購于大興安嶺華野生物工程有限公司(ACN含量為25%),實驗中經過XAD-7樹脂柱進一步純化,得到ACN含量為35%。

F-7000型熒光光度計 日本Hitachi公司；XB 220A型電子天平 PrecisaGravimetric AG公司；pHS-3C+型酸度計 成都市紀方舟科技有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；培英THZ-C型恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制BSA和ACN儲備液配制 將BSA和ACN分別溶解于去離子水(dH2O,pH7.4)中,配成1.5×10-4mol/L和1.5×10-3mol/L的BSA和ACN儲備液,保存于4℃的冰箱中備用,實驗在4h內完成。移取1.0mL BSA儲備溶液于15mL離心管中,再加ACN儲備液,得到ACN與BSA的摩爾濃度比是0、1、2、4、6、8、10、12,并用dH2O(pH7.4)定容至10mL,用渦流振蕩器混勻待用。最終BSA的濃度為1.5×10-5mol/L,ANC的濃度分別是0、1.5×10-5、3×10-5、6×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。以不加ACN的BSA溶液為空白。

1.2.2 紫外光譜和熒光光譜測定 精確移取3.0mL樣品于石英皿中,在波長200～380nm范圍內掃描其紫外吸收光譜；將樣品分別在(25、30、35℃)水浴箱中保持恒溫,空白為1.5×10-4mol/L的BSA溶液,移取3.0mL樣品于石英皿,測定熒光光譜的條件如下:激發波長280nm,激發狹縫2.5nm,發射狹縫5nm。測定其同步熒光光譜條件如下:分別固定Δλ=15nm和Δλ=60nm。

1.3 Stern-Volmer與Tachiya的計算

1.3.1 Stern-Volmer;Stern-Volmer 常用于判斷猝滅類型,且適合用于計算靜態猝滅類型中的結合常數Ka和結合位點數n。用Stern-Volmer[6]進一步對熒光數據進行分析,闡明ACN與BSA相互作用的結合常數、結合位點等方面:

F0/F=KSV[Q]+1=Kqτ0[Q]+1

式(1)

式中:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強度,KSV為動態猝滅常數,[Q]為ACN的濃度,Kq為雙分子猝滅過程速率常數,τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命,生物大分子熒光壽命約10-8s[7]。對于猝滅過程中的Ka、n,可由(1)得知

lg[(F0-F)/F]=nlg[Q]+lgKa

式(2)

式中:n為結合位點數,[Q]為ACN的濃度,Ka為結合常數。

1.3.2 Tachiya;Tachiya等則認為一個熒光體分子上所含有的可以與猝滅劑結合的位點數可能和實際與熒光體結合的猝滅劑分子數不同,并由此得出Tachiya模型公式。利用Tachiya進一步對熒光數據進行分析,闡明ACN與BSA相互作用的結合模式,包括:結合常數、結合位點等方面[8]。

Tachiya中ACN與BSA之間的吸附與解吸可用下式表示:

Bn+Qaq→Bn+1

式(3)

Bn→Bn+1+Qaq

式(4)

式中,Qaq為猝滅劑分子ACN的濃度；Bn表示結合了n個猝滅分子的BSA。如果ACN與BSA相互作用的結合位點固定值,則ACN的分子數目遵循二項分布式:

式(5)

式中,BSA中結合的ACN的平均數目為nav:

式(6)

式中:K=k1/k2,k1是吸附速率常數,k2是解吸速率常數。若用[M]表示BSA的濃度,則加入ACN的總濃度[Q]為:

[Q]=nav[M]+[Qaq]

式(7)

聯立式(6)和式(7)得到:

式(8)

BSA與ACN的能量轉移速率常數為:

式(9)

式中：τ0為沒有ACN存在時BSA的熒光壽命,r是BSA與ACN的結合距離,R0為E=50%的臨界距離,此時熒光強度會變為:

式(10)

因此無論是否存在ACN,二者淬滅熒光強度的比值:

式(11)

其中:[M]、[Q]和F/F0的值可由實驗確定,結合式(8)和(11),可得出m、Ka和r的值。然而當[Q]達到飽和狀態時,F/F0也會飽和。BSA分子上的所有結合位點都已被ACN占用,再增加[Q]也不會增加結合數,此時熒光強度會變為:

式(12)

另外[Q]極低時,ACN與BSA結合的平均數nav很小,結合(1-8)得到:

式(13)

從而此時熒光強度為:

式(14)

1.4ANC與BSA相互作用的探討

1.4.1ACN與BSA結合作用力的類型根據分子結構可知,蛋白質等生物大分子與有機小分子之間的作用力應當屬于分子間的弱相互作用,包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等[9]。通過計算一些熱力學參數,如焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能ΔG,可以判斷子蛋白質等生物大分子與有機小分之間的主要作用力。在溫度變化范圍不大時,作用過程的焓變ΔH隨溫度的改變可忽略不計,近似認為常數。相關公式如下:

ln(K2/K1)=[1/T1-1/T2]ΔH/R

式(15)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

式(16)

可以確定ΔH、ΔS和ΔG的數值,從而判斷ACN與BSA結合的作用力類型。

1.4.2ACN與BSA相互作用的結合距離 根據F?rster能量轉移理論[10]:

E=1-(F/F0)=R06/(R06+r6)

式(17)

式中:E是ACN與BSA之間的能量轉移效率,F和F0分別為加入和未加入ACN時BSA的熒光強度,R0為E=50%時的臨界距離:

R06=8.8×10-25K2n-4ΦJ

式(18)

式中:K2為偶極空間取向因子,n為介質的折射指數,Φ為BSA的熒光量子產率,J為BSA熒光光譜與ACN吸收光譜的重疊積分,可表示為:

式(19)

其中:F(λ)為熒光供體在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。由此可以確定ACN與BSA相互作用時的結合距離r。

2 結果與分析

2.1 ACN與BSA相互作用的熒光猝滅光譜

在BSA溶液中加入不同濃度的ACN溶液,隨著ACN濃度的增大,BSA熒光光譜被有規律的猝滅且熒光峰從340nm紅移到345nm(圖1)。

蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸均有熒光產生,但酪氨酸殘基的熒光較弱,其變化很難觀察到而色氨酸殘基熒光很強,因此主要觀察色氨酸的熒光變化。激發波長為280nm時,BSA在343nm有最大發射波長,而在304nm沒有熒光峰形成。BSA熒光發生了猝滅,說明BSA分子中色氨酸殘基空間位置發生了改變；而BSA熒光峰的紅移說明色氨酸區域變得更加親水[11]。ACN屬于水溶性的小分子,可以與親水的側鏈殘基結合,因此可以推斷是位于BSA分子表面的色氨酸殘基發生了位置的改變[12]。

圖1 不同濃度的ACN與BSA的熒光猝滅圖Fig.1 Fluorescencespectra of BSA in the presence of different concentrations of ACN注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:0,1.5×10-5, 3×10-5,6×10-5,9.0×10-5,12.0×10-5, 15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1.T=298K。

2.2 ACN與BSA相互作用的同步熒光光譜

BSA的濃度不變,逐漸增加ACN的濃度,測定Δλ=15 nm和Δλ=60nm時的同步熒光光譜(圖2A和2B)。由圖可知,隨著ACN濃度的增加,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強度明顯減小,但酪氨酸殘基的熒光峰波長沒有明顯變化(圖2A),表明ACN對酪氨酸殘基微環境幾乎沒有影響；而色氨酸熒光峰波長發生了從280nm到278nm的微小藍移(圖2B),表明色氨酸殘基所處的微環境發生了改變,并且色氨酸殘基熒光猝滅程度高于酪氨酸殘基,表明ACN與BSA的結合位點更接近于色氨酸殘基。

在蛋白質的同步熒光光譜中,Δλ=15nm時顯示的是酪氨酸殘基的光譜性質,Δλ=60nm顯示的是色氨酸殘基的光譜性質[13]。蛋白質中氨基酸殘基的最大發射波長的變化與自身所處環境的極性有關,因此蛋白質構象的變化可通過由最大發射波長的改變來判斷[14]。

圖2 ACN-BSA的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous scanning fluorescence spectra of ACN-BSA注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:0,1.5×10-5, 3.0×10-5,6.0×10-5,9.0×10-5,12.0×10-5, 15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1. T=302K。

2.3 ACN與BSA結合作用力的類型

根據熱力學參數之間的關系式(15)、(16)可以求得反應前后熱力學焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能ΔG的數值(表1),以此判斷ACN與BSA之間的主要作用力類型[15]。

表1 不同溫度下ACN與BSA作用的熱力學參數Table 1 Thermodynamics constants of ACN-BSA system at different temperatures

由表1可知,BSA與ACN相互作用時,ΔG<0,ΔS>0,ΔH<0。

結果表明,ΔG<0,說明BSA與ACN的結合作用是自發過程。ΔS>0,ΔH<0,說明BSA與ACN分子間主要以靜電引力相互結合[15]。

2.4 ACN與BSA相互作用的結合距離

圖3為BSA的熒光光譜和ACN的吸收光譜的重疊圖,根據F?rster能量轉移理論公式可以確定J=3.69×10-154cm3·mol-1,R0=3.17nm,E=0.57。進一步可以得到r=4.02nm。

當供體蛋白的熒光發射光譜與受體小分子的吸收光譜存在一定程度的重疊,且二者間的結合距離小于7nm時,二者之間將會發生非輻射能量轉移現象,從而供體蛋白發生熒光猝滅[16]。由于r<7 nm,0.5R0

圖3 ACN的吸收光譜和BSA的熒光光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectrum of Anthocyanin and fluorescence emission spectrum of BSA注:BSA:1.5×10-5mol·L-1, ACN:1.5×10-5 mol·L-1,T=298K。

2.5 不同計算公式探究ACN與BSA的相互作用

2.5.1 探究熒光猝滅機理及猝滅常數KSV根據Stern-Volmer作出F0/F-[Q]關系圖并計算出不同溫度下的動態猝滅常數KSV(圖4和表2)。

圖4 ACN與BSA作用的Stern-Volmer圖Fig.4 Stern-Volmer graph of ACN with BSA at different temperatures注:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強度; [Q]為ACN的濃度:1.5×10-5,3.0×10-5,6.0×10-5, 9.0×10-5,12.0×10-5,15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1。

表2 ACN-BSA的Stern-Volmer猝滅常數Table 2 Stern-Volmer constants of interaction between ACN and BSA

注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:1.5×10-5、3.0×10-5、6.0×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。

表3 不同溫度下ACN與BSA作用的n和KaTable 3 Then and Ka of BSA-anthocyanin system at different temperature

注：BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:1.5×10-5、3.0×10-5、6.0×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。 從表2的數據看出,隨著溫度的升高,ACN與BSA相互作用的動態猝滅常數KSV值在減小,表明該猝滅機理為靜態猝滅[18]。然而Tachiya模型不能對二者的熒光數據進行猝滅機理的研究。

2. 5.2 探究結合常數Ka、結合位點數n及結合距離r

2.5.2.1 結合參數(Ka、n、r)的確定 圖5中直線的斜率即n,截距即lgKa,根據斜率和截距即可計算出不同溫度下的Ka(見表3)。

圖5 ACN-BSA體系的 lg[(F0-F)/F]對lg[Q]圖Fig.5 Plots of lg[([(F0-F)/F]-lg[Q] for ACN-BSA system at different temperatures注:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強度; [Q]為ACN的濃度:1.5×10-5,3.0×10-5,6.0×10-5, 9.0×10-5,12.0×10-5,15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1。

由表3的數據看出,ACN與BSA相互作用的Ka隨著溫度的升高而降低。這是因為升高溫度后ACN與BSA的結合能力減弱了；而二者的n幾乎不隨溫度的變化而變化,且接近于1,表明ACN與BSA相互作用后形成1∶1的靜態配合物[19]。

2.5.2.2 結合參數(Ka、n、r)的確定 通過Tachiya模型可知,當[Q]足夠低時,F/F0與[Q]成比例,且Ka、r和[M]決定其比例系數。因此通過測量兩個不同[M]值時的F/F0與[Q]的曲線,可以確定Ka、r的值。

由圖6得到BSA與ACN相互作用的Ka、n如表4所示:

圖6 不同溫度時的Q-F0/F關系圖 Fig.6 Curves of F/F0 versus concentration of ACN at different temperatures注:A.298K,B.303K,C.308K。

由表4可知:由Tachiya模型得到的Ka、n均隨溫度的升高而增大。

3 討論

結果表明,在Stern-Volmer和Tachiya模型得到的r均小于7nm,表明小分子的部分片段能夠插入BSA分子內部[20],因此非輻射能量轉移是引起熒光猝滅的原因之一。通過Tachiya計算所得的Ka隨溫度的升高而增大,而Stern-Volmer得到的Ka隨溫度的升高而降低；Stern-Volmer得到的n幾乎不隨溫度的變化而變化,但Tachiya所得n隨溫度的升高而增大。因此使用兩個模型計算所得結合參數(Ka、n)有明顯差別。

表4 Tachiya模型得到ACN-BSA相互作用的KaTable 4 The binding parameters of ACN-BSA system by Tachiya model

這主要是Tachiya模型考慮到了理論結合位點數m與實際結合位點數n的差異,當猝滅劑濃度[Q]達到飽和狀態時,熒光生物大分子(P)上的所有結合位點都已被猝滅劑占用,再增加[Q]也不會增加結合數[21]；而當[Q]極低時,與 P結合的平均數很小,這兩種情況下得到的熒光強度是不同的,而Stern-Volmer則假定m即是小分子實際結合在蛋白質上的數量n,只能采用相同的熒光強度,這可能并不符合實際情況。因此Tachiya模型更符合生物大分子與小分子相互作用的實際情況[22]。

4 結論

花青素對牛血清白蛋白的熒光存在較強的靜態猝滅作用,靜電引力是其主要作用力,二者的結合位點更接近于色氨酸殘基。根據Stern-Volmer和Tachiya模型所得結合距離r均小于7nm,而結合常數(Ka、n)與溫度的關系卻有很大的差異。Stern-Volmer得到的n幾乎不隨溫度的變化而變化,但Tachiya所得n隨溫度的升高而增大。這主要是由于兩種理論模型對理論結合位點數m與實際結合位點數n進行了不同處理分析,Tachiya模型將理論結合位點數m與實際結合位點數n進行了區別比較分析。而Stern-Volmer方程則假定m即是小分子實際結合在蛋白質上的數量n,這可能并不符合實際情況。因此Tachiya模型更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。

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Study on the Anthocyanin and Bovine Serum Albumin interactionbased on Stern-Volmer Equation and Tachiya model

SONG Lan-lan,ZHOU Rui,JING Hao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The spectroscopic characteristics of BSA and ACN interaction with the different temperatures(25,30,35℃)in water system was investigated,using the fluorescence,synchronous fluorescence and UVvisible spectroscopy. The thermodynamic and the binding parameters(binding constants,binding distance and number of binding sites)of BSA and ACN interaction under different temperature were obtained from the Tachiya model and Stern-Volmer equation,respectively. The results showed that the intrinsicfluorescence intensity of BSA was quenched by CAN and the quenching type was static quenching. The magnitude of thermodynamic parameters ΔH,ΔS for the interaction at different temperatures indicated that the electrostatic interactions played a main role in the binding of ACN to BSA. The synchronous fluorescence spectra of BSA showed that the maximum absorption wavelength of tryptophan residue shifted toward the short wavelength direction caused by the addition of ACN,indicating that the two binding sites closer to the tryptophan residues. According to Stern-Volmer equation,the binding constant decreased as the temperature increased. The number of binding siteswas not affected by temperature. Based on the Tachiya model,the binding constant and binding sites would increase with the increase of temperature.Therefore,the number of binding sitesis hardlychanges with the temperature obtained by Stern-Volmer,butthe actualnumber of binding sites increased with the increase of temperature obtained by Tachiya. So the Tachiya model could be more in line with the actual situation of the interaction between small molecule and biological macromolecule.

Anthocyanin;Bovine serum albumin;Tachiya model;Stern-Volmer equation;Interaction

2014-04-2

宋蘭蘭(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：蛋白與活性小分子物質的相互作用。

*通訊作者:景浩(1957-)，男，博士，教授，研究方向：分子營養與食品安全。

國家自然科學基金項目(31171676)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)03-0099-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.012