Maillard反應(yīng)對卵白蛋白穩(wěn)定性的影響

金 婷,畢海丹,馮曉慧,于 濱

(棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160)

Maillard反應(yīng)對卵白蛋白穩(wěn)定性的影響

金 婷,畢海丹,馮曉慧,于 濱*

(棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160)

為了確定Maillard反應(yīng)對卵白蛋白穩(wěn)定性的影響,本文研究了Maillard反應(yīng)卵白蛋白處于酶解、酸性環(huán)境、加熱、變性劑、反復(fù)凍融等不利條件下的理化特點(diǎn)。結(jié)果表明Maillard反應(yīng)抑制了蛋白酶對卵白蛋白的酶解效果。Maillard反應(yīng)卵白蛋白在pH2～7的范圍內(nèi),空間結(jié)構(gòu)伸展程度較小。Maillard反應(yīng)將卵白蛋白的變性溫度從71.3℃提高到76.9℃,明顯改善了卵白蛋白的熱穩(wěn)定性。6mol·L-1的尿素能夠使熱處理卵白蛋白和天然態(tài)卵白蛋白完全變性,而只能使Maillard反應(yīng)卵白蛋白部分變性。Maillard反應(yīng)能夠提高卵白蛋白的溶解度,其溶解度經(jīng)過反復(fù)凍融后仍處于較高水平。Maillard反應(yīng)可以有效提高卵白蛋白穩(wěn)定性,從而保證卵白蛋白功能性的發(fā)揮。

卵白蛋白,Maillard反應(yīng),穩(wěn)定性,理化特點(diǎn)

蛋清蛋白作為一種食品加工原料具有廣泛的應(yīng)用范圍[1],一方面是由于蛋清蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值高、資源豐富、原料成本低,另一方面則是因?yàn)榈扒宓鞍拙哂信c食品的嗜好性、加工性等相關(guān)聯(lián)的各種功能性質(zhì),如起泡性、吸油性、吸水性與持水性、凝膠性等,它們是蛋清蛋白質(zhì)本身固有的物化性質(zhì)[2]。卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白質(zhì),其含量占蛋清蛋白質(zhì)的54%,卵白蛋白的性質(zhì)決定了蛋清蛋白的功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)除了受蛋白質(zhì)本身影響外(成分、氨基酸序列、形態(tài)結(jié)構(gòu)等),它們的發(fā)揮還受與其共存的某些食物組分(水、鹽、蛋白質(zhì)、糖、脂肪等)的影響,同時(shí)還受所接觸環(huán)境(溫度、pH、電離強(qiáng)度等)、加工條件(殺菌、均質(zhì)、干燥)的影響,因此蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的發(fā)揮是由多方面因素所決定的[3],而具有良好穩(wěn)定性是保證蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的關(guān)鍵。Maillard反應(yīng)是將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上氨基(主要為Lys的ε-氨基)或羧基相結(jié)合的化學(xué)反應(yīng),被廣泛用于提高蛋白功能特性[4]。目前已有很多研究通過Maillard反應(yīng)改善了大豆蛋白、乳清蛋白、蛋清蛋白等的功能性質(zhì)[5-7],其研究重點(diǎn)主要集中于蛋白質(zhì)的溶解度、凝膠性、乳化性等方面[8-9],而關(guān)于Maillard反應(yīng)修飾后的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究相對較少,因此本文以蛋清蛋白的主要蛋白——卵白蛋白為研究對象,分析Maillard反應(yīng)對卵白蛋白穩(wěn)定性的影響,為Maillard反應(yīng)在蛋白質(zhì)改性的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 購自棗莊大潤發(fā)超市；麥芽糊精(DE15) 山東潤康生物工程有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶 鄭州鴻祥化工有限公司；中性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；8-苯氨基-萘酚-磺酸(ANS)Sigma試劑公司:尿素 天津市化學(xué)試劑三廠。其他化學(xué)試劑均為分析純。

TU-1800紫外可見分光光度計(jì) 北京普析儀器公司；FDU-1100冷凍干燥機(jī) 日本EYELA公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Pyris6差示量熱掃描儀 Perkin Elmer；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵白蛋白的制備 采用硫酸銨鹽析加一次等電點(diǎn)沉降的工藝制備卵白蛋白[10](天然態(tài)卵白蛋白),經(jīng)Sephadex G100葡聚糖凝膠柱層析,洗脫曲線呈單一峰型,表明卵白蛋白純度較高,可以用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣品的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11],將麥芽糊精與卵白蛋白按照5%的比例混合、溶解,經(jīng)冷凍干燥制得卵白蛋白-麥芽糊精混合粉,然后將混合粉置于含有飽和KI溶液(65%相對濕度)的封閉容器中,在60℃條件下保溫3d,即得卵白蛋白-麥芽糊精共聚物(Maillard反應(yīng)卵白蛋白)。以未加入麥芽糊精的卵白蛋白為對照樣品(熱處理卵白蛋白),進(jìn)行相同處理,以分析卵白蛋白-麥芽糊精體系中未反應(yīng)卵白蛋白對體系穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 游離氨基相對含量分析 采用OPA法對卵白蛋白中糖基化程度進(jìn)行測定。取OPA試劑4mL,加入200μL蛋白溶液(10mg·mL-1),35℃反應(yīng)2min,以O(shè)PA試劑中加入200μL水為空白,340nm下測定吸光值。游離氨基相對含量計(jì)算公式如下:游離氨基相對含量(%)=At/A0×100,其中At表示t時(shí)刻樣品的吸光值,A0表示未反應(yīng)樣品的吸光值。

1.2.4 褐變程度分析 將蛋白配制成1%的溶液,4000r·min-1離心10min,420nm進(jìn)行比色,以A420nm表征褐變程度。

1.2.5 卵白蛋白酶解性能分析 將樣品配制成5%的蛋白溶液,在胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的最適合條件下水解1h,沸水浴10min滅酶,4000r·min-1離心收集上清液,利用茚三酮法測定水解度[12]。

1.2.6 酸性環(huán)境對卵白蛋白熒光強(qiáng)度的影響 配制濃度為10mg·mL-1的樣品溶液,用1mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH為2～7,取樣品溶液4mL,加入20μL的ANS溶液(采用0.02mol·L-1,pH7.4磷酸緩沖液)作為熒光探針,并于室溫條件下保持30min,采用熒光分光光度計(jì)在390nm的激發(fā)波長和480nm的發(fā)射波長下測定樣品的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 卵白蛋白的熱穩(wěn)定性分析 本實(shí)驗(yàn)將蛋白粉1∶7(w/v)溶于0.02mol·L-1,pH7.0磷酸鹽緩沖溶液中,采用差示掃描量熱儀分析,掃描溫度40～90℃,30℃保留1min,掃描速率2℃/min,90℃保留1min。利用儀器自帶軟件分析圖譜,得到卵白蛋白的峰值溫度。

1.2.8 變性劑處理對蛋白熒光強(qiáng)度的影響 將糖基化蛋白溶解于0～6mol·L-1的尿素溶液中,配制成蛋白濃度為1mg·mL-1的溶液,采用熒光分光光度計(jì)在370nm的激發(fā)波長和470nm的發(fā)射波長下測定樣品的熒光強(qiáng)度。

1.2.9 冷凍-融化對蛋白溶解度的影響 配制10%的蛋白質(zhì)溶液,置于-20℃的冰柜中凍結(jié),24h后取出,在室溫條件下解凍,即完成一次冷凍-融化過程,依次完成1、3、5次冷凍-融化循環(huán),并對樣品溶液進(jìn)行溶解度分析,其測定方法參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。單因素方差分析利用SPSS V17.0的One-way ANOVA程序進(jìn)行分析。均數(shù)間比較利用Tukey檢驗(yàn)分析(樣本數(shù)n=3,p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Maillard反應(yīng)程度分析

游離氨基與褐變程度是表征Maillard反應(yīng)進(jìn)行程度的主要指標(biāo),本文對反應(yīng)過程中的相對游離氨基含量與褐變程度進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,隨著Maillard反應(yīng)時(shí)間的延長,游離氨基相對含量不斷下降,反應(yīng)0.5d后,游離氨基相對含量減少11.9%,隨后游離氨基含量降低趨于平緩,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3d時(shí),游離氨基含量減少了19.9%。隨著Maillard反應(yīng)時(shí)間的不斷延長,褐變程度稍有增加,但其最大值不超過0.12。游離氨基相對含量與褐變程度的變化結(jié)果表明Maillard反應(yīng)已基本完成,且反應(yīng)進(jìn)程基本處于Maillard反應(yīng)的初期或中期階段。

圖1 卵白蛋白游離氨基和褐變程度的變化Fig.1 Changes in free amino groups content and browning of ovalbumin

2.2 卵白蛋白酶解性能分析

蛋白質(zhì)在酶的作用下,結(jié)構(gòu)打開的難易程度是描述其穩(wěn)定性的重要指標(biāo),它和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、形狀等都有密切關(guān)系[14]。為了研究Maillard反應(yīng)卵白蛋白的穩(wěn)定性,通過比較不同蛋白酶水解卵白蛋白的水解度,來反映蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。三種蛋白酶水解卵白蛋白的能力次序是堿性蛋白酶>胃蛋白酶>中性蛋白酶,三種卵白蛋白在不同蛋白酶的水解作用下,其水解度以熱處理卵白蛋白為最大,卵白蛋白在熱處理過程中,其分子空間結(jié)構(gòu)不斷伸展,使得蛋白酶的活性中心很容易與蛋白質(zhì)的水解位點(diǎn)相互作用[15]。Maillard反應(yīng)卵白蛋白在三種蛋白酶的作用下,其水解度低于熱處理卵白蛋白,但高于天然態(tài)卵白蛋白的水解度。這可能是Maillard反應(yīng)與熱處理綜合作用的結(jié)果。糖分子基團(tuán)的出現(xiàn)使得反應(yīng)位點(diǎn)周圍的肽鍵具有立體位阻效應(yīng)[16],這阻礙了Maillard反應(yīng)蛋白與蛋白酶的活性中心不易接近。

圖2 卵白蛋白酶解性能分析Fig.2 Analysis in enzymolysis performance of ovalbumin

2.3 酸性環(huán)境對卵白蛋白熒光強(qiáng)度的影響

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在極端的pH條件下,由于靜電相互作用受到干擾,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[17]。不同電荷分子間形成鹽橋的能力下降,從而降低蛋白質(zhì)的靜電自由能,從而導(dǎo)致全面的伸展[18]。通過分析卵白蛋白在酸性條件下的熒光強(qiáng)度的變化,表征其在酸性條件下的結(jié)構(gòu)的伸展程度,結(jié)果如圖3所示。從結(jié)果可以看出,三種卵白蛋白的熒光強(qiáng)度都隨著pH的降低而不斷增加,這說明蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸不斷暴露,分子結(jié)構(gòu)不斷伸展。但是在相同pH條件下,熱處理卵白蛋白的熒光強(qiáng)度要高于天然態(tài)卵白蛋白和Maillard反應(yīng)卵白蛋白,這與其處理過程中的受熱有關(guān)。當(dāng)pH高于天然態(tài)卵白蛋白等電點(diǎn)(4.5),三種蛋白熒光強(qiáng)度增加不明顯,而當(dāng)pH低于4.5時(shí),天然態(tài)卵白蛋白與熱處理卵白蛋白的熒光強(qiáng)度明顯增加。Maillard反應(yīng)卵白蛋白的熒光強(qiáng)度在pH為4.5～7.0之間是高于天然態(tài)卵白蛋白,這是由于pH對卵白蛋白的熒光強(qiáng)度影響較小,Maillard反應(yīng)過程能夠增加卵白蛋白的疏水性[19]。而pH在2.0～4.5之間,天然態(tài)卵白蛋白熒光強(qiáng)度高于Maillard反應(yīng)卵白蛋白,這時(shí)強(qiáng)烈的靜電斥力使得天然態(tài)卵白蛋白結(jié)構(gòu)伸展,而Maillard反應(yīng)卵白蛋白周圍水分子的電荷屏蔽作用,降低了靜電斥力對卵白蛋白結(jié)構(gòu)的影響[20]。

圖3 pH對卵白蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of pH on fluorescence intensity of ovalbumin

2.4 卵白蛋白的熱穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)在加熱時(shí),蛋白質(zhì)分子展開過程中需要吸收能量即為變性熱。蛋白質(zhì)的熱分析就是通過加熱破壞蛋白質(zhì)的二級,三級和四級結(jié)構(gòu)并測得變性過程中的能量變化情況。本文利用差示掃描量熱儀(DSC)分析卵白蛋白的熱變性過程,結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出,在加熱過程中三種卵白蛋白的DSC圖有著很大的差別,各掃描曲線的出峰時(shí)間和形狀差異明顯不同。Maillard反應(yīng)卵白蛋白的變性溫度達(dá)到76.9℃,而天然態(tài)卵白蛋白與熱處理卵白蛋白的變性溫度較低,分別為71.3℃和65.2℃。這說明Maillard反應(yīng)有效的提高卵白蛋白的熱穩(wěn)定性,很多學(xué)者已經(jīng)證明Maillard反應(yīng)可以提高乳球蛋白[21]、大豆蛋白[22]的熱穩(wěn)定性。Maillard反應(yīng)可以顯著提高蛋白質(zhì)的變性溫度,改善程度與糖分子含量有關(guān)[23]。

圖4 卵白蛋白的熱穩(wěn)定性分析Fig.4 Thermal stability of ovalbumin

2.5 尿素對卵白蛋白熒光強(qiáng)度的影響

蛋白質(zhì)變性的難易程度與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān),結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定越不易變性[24],本研究中為了分析卵白蛋白的穩(wěn)定性,將卵白蛋白處于不同濃度尿素中進(jìn)行變性,以破壞維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的氫鍵和疏水相互作用。從圖5中可以看出,隨著尿素濃度的不斷增加,熒光強(qiáng)度也在不斷的增加,這表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在不斷的伸展,內(nèi)部疏水性基團(tuán)不斷暴露。當(dāng)尿素濃度大于4mol·L-1時(shí),熱處理卵白蛋白的熒光強(qiáng)度趨于平緩,這說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已經(jīng)充分展開,天然態(tài)卵白蛋白在尿素濃度大于5mol·L-1時(shí)才出現(xiàn)這種現(xiàn)象。而Maillard反應(yīng)卵白蛋白熒光強(qiáng)度是隨著尿素濃度線性增加,這說明Maillard反應(yīng)卵白蛋白空間結(jié)構(gòu)仍未被全部打開,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相對較好。這可能也與Maillard反應(yīng)增加蛋白質(zhì)的氫鍵有關(guān)[25]。

圖5 尿素對卵白蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of urea on fluorescence intensity of ovalbumin

2.6 反復(fù)凍融對卵白蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)在凍藏過程中,由于冰晶的形成,使得蛋白質(zhì)變性,溶解度降低[26],本文研究了不同凍融循環(huán)次數(shù)對卵白蛋白溶解度的影響,結(jié)果如圖6所示。從結(jié)果中可以看出,Maillard反應(yīng)卵白蛋白的溶解度是最大,未經(jīng)凍融處理時(shí),其溶解度可以達(dá)到96.3%,這與許多報(bào)道Maillard反應(yīng)可以顯著的改善蛋白質(zhì)的溶解度是一致[27]。而熱處理卵白蛋白的溶解度相對于天然態(tài)卵白蛋白稍有下降。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加,三種卵白蛋白的溶解度均是不斷下降的,其中天然態(tài)卵白蛋白和熱處理態(tài)卵白蛋白溶解度經(jīng)過5次凍融后,其溶解度分別下降了12.6%和11.7%,而Maillard反應(yīng)卵白蛋白溶解度降低7.8%,由此可見Maillard反應(yīng)卵白蛋白對于凍融處理具有較高的抵抗能力,這可能與卵白蛋白表面結(jié)合糖分子的羥基有關(guān),羥基通過氫鍵吸附水分子,從而形成保護(hù)膜,減少冰晶對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的溶解度[28]。

圖6 反復(fù)凍融對卵白蛋白溶解度的影響Fig.6 Effect of freeze-thaw cycles on solubility of ovalbumin

3 結(jié)論

基于Maillard反應(yīng)制備了卵白蛋白-麥芽糊精共聚物,并對其穩(wěn)定性進(jìn)行分析。當(dāng)Maillard反應(yīng)卵白蛋白在三種蛋白酶的作用下,均呈現(xiàn)出抵制酶水解的特點(diǎn)。而在酸性環(huán)境中(pH2～7),Maillard反應(yīng)卵白蛋白熒光強(qiáng)度變化較小,這說明其空間結(jié)構(gòu)變化較小,Maillard反應(yīng)降低了靜電斥力對卵白蛋白穩(wěn)定性的影響。DCS掃描分析表明Maillard反應(yīng)提高了卵白蛋白的變性溫度,提高了卵白蛋白的熱穩(wěn)定性。在尿素濃度為1～6mol·L-1的條件下,Maillard反應(yīng)卵白蛋白的熒光強(qiáng)度隨著尿素濃度的增加而增加,Maillard反應(yīng)卵白蛋白的空間結(jié)構(gòu)仍未完全打開。Maillard反應(yīng)卵白蛋白經(jīng)過5次凍融后,其溶解度高于80%,說明Maillard反應(yīng)卵白蛋白對于凍結(jié)的脫水作用及冰晶的物理擠壓都具有較好的抵抗能力。Maillard反應(yīng)提高了卵白蛋白在酶解、酸性環(huán)境、加熱、變性劑、凍融等不利條件下的穩(wěn)定性,有助于擴(kuò)大卵白蛋白的應(yīng)用范圍。

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Effect of Maillard reaction on the stability of Ovalbumin

JIN Ting,BI Hai-dan,FENG Xiao-hui,YU Bin*

(College of Life Science,Zaozhuang University,Zaozhuang 277160,China)

In order to determine the effect of Maillard reaction(MR)on the stability of ovalbumin,physiochemical characteristic of ovalbumin modified by MR(OMR)subjected to enzymolysis,acidic conditions,heating,denaturant,freeze-thaw cycles were analyzed. The results showed that hydrolytic activities of proteases on ovalbumin were inhibited by MR. The three-dimensional structures of OMR showed a little change at pH range of 2～7. The denaturation temperature of ovalbumin was rise from 71.3℃ to 76.9℃ by MR,which improved the heat stability of ovalbumin. 6mol·L-1urea induced completely denaturation of native and heated ovalbumin,as well as partially denaturation of OMR. The solubility of ovalbumin was improved by MR. OMR displayed a better solubility after treatment of several freeze-thaw cycles. Improvement in stability of ovalbumin by MR was beneficial to functional properties of ovalbumin.

Ovalbumin;Maillard reaction;stability;physiochemical characteristic

2014-04-29

金婷(1980-)，女，碩士，講師，研究方向：食品化學(xué)。

*通訊作者:于濱(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)。

山東省高等學(xué)校科技發(fā)展計(jì)劃(J12LD51)。

TS253.1

A

1002-0306(2015)03-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.017