梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的理化性質及其結構研究

高呈琳，張小爽，陳 健

(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的理化性質及其結構研究

高呈琳，張小爽，陳 健

(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

以梭柄松苞菇子實體為原料,采用超聲輔助水提醇沉法,經脫色、脫蛋白、DEAE-52離子交換柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2,用高效凝膠滲透色譜(GPC)結合葡聚糖凝膠Sephadex G-100的分離結果鑒定其分子量分布及純度,利用碘-碘化鉀、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍G-250法、硫酸-咔唑法對其淀粉含量、總糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量進行測定；經紫外光譜分析、紅外光譜分析、GC分析其官能團特征及單糖組成。結果表明,CVP-Ⅱ2為非淀粉白色絮狀均一多糖,其總糖、蛋白質含量、糖醛酸含量分別為:總糖含量為86.76%,不含蛋白質,糖醛酸含量為12.93%；其重均相對分子量Mw為11252u；紅外光譜顯示CVP-Ⅱ2具有多糖的特征吸收峰且為吡喃型糖環構型；單糖組成結果顯示CVP-Ⅱ2含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02。

梭柄松苞菇,多糖,分離純化,理化性質,結構

梭柄松苞菇(Catathelasmaventricosum(Peck)Sing)[1],屬真菌界、傘菌目、白蘑科、松苞菇屬。又名梭柄乳頭蘑、老人頭菌、松苞菇(云南)、紗羅包、羅漢菌(四川)、松杉苞。該菌多生長于海拔1200米以上,松、杉木、油杉等針闊葉林中陰濕疏松的地上,尤其在有稀疏陽光照射、且有落葉覆蓋的緩坡上更為常見,單生至群生,對生長環境非常挑剔,人工無法培植,主要分布于黑龍江、四川、貴州、云南、西藏等地區。蛋白質含量豐富,氨基酸品種齊全,并且含有豐富的礦物質及維生素,對梭柄松苞菇的藥用療效,《本草綱目》及《滇南本草》記載梭柄松苞菇 “氣味辛、平、無毒、性溫,主治心脾暴痛。高秀君[2]、Liu Yun-tao[3-5]、劉蒙蒙等[6]、李張等[7]均對梭柄松苞菇多糖的各種活性進行探索,發現得到的梭柄松苞菇多糖具有較好的降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化等各種功能活性,并且有少量的結構研究,其理化性質、結構分析以及構效關系上研究甚少。本文論述超聲輔助提取得到的梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的提取、分離純化、理化性質、結構等方面的系統研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梭柄松苞菇 購于廣州一德路干貨市場；葡萄糖、單糖標準品、牛血清白蛋白、半乳糖醛酸、考馬斯亮藍G-250 美國sigma公司生產；WhatmenDEAE-52 廣州展晨生物科技有限公司進口分裝；D354FD樹脂 廣州市廣聯津化工有限公司生產；苯酚、濃硫酸、95%乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、疊氮化鈉、三氟乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、鄰苯二甲酸氫鉀、濃磷酸、四硼酸鈉、咔唑、碘、碘化鉀 均為國產分析純；磷酸二氫鉀,化學純；Sephadex G-100 Pharmacia公司。

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DHB-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DSA-129粉碎機,美的有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 河南省鞏義予華儀器有限公司；KQ-250V超生波清洗器 昆山市超生儀器有限公司；KDC-4低速離心機 科大創新股份有限公司；UV-5000分光光度計 上海元析儀器有限公司；98-1-B調溫電熱套 天津市泰斯儀器有限公司；BT-200恒流泵、DBS-100自動部分收集器 上海滬西儀器廠；Waters2410示差檢測器、717plus自動進樣器、1525HPLC泵 美國Waters公司；DE-310冷凍干燥器,德國威思公司；HHS恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AGLIENT6890T氣相色譜系統 美國AGLIENT公司；Vector33傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖制備分離純化工藝 梭柄松苞菇子實體→粉碎過20目篩→超聲輔助熱水浸提→離心→減壓濃縮→D354FD樹脂脫色→醇沉→離心→Sevage法脫蛋白→醇沉→離心→沉淀溶解→DEAE-52離子交換柱層析(規格為2.6×30cm的Z型層析柱,平衡后7s/滴。)→0.05mol/L NaCl洗脫→收集組分→減壓濃縮→透析→冷凍干燥→得到CVP-Ⅱ→CVP-Ⅱ復溶→Sephadex G-100凝膠柱層析(規格為2.6×30cm的Z型層析柱,平衡后15s/滴。)→CVP-Ⅱ2純品[8]。

1.2.2 梭柄松苞菇子實體多糖CVP-Ⅱ2的相對分子質量測定及純度鑒定 CVP-Ⅱ2的均一程度和相對分子質量用高效凝膠滲透色譜測定。色譜條件:TSK-GEL G-4000PWXL柱(7.8mm×300mm)與TSK-GEL G-2500PWXL柱(7.8mm×300mm)串聯；流動相為0.02mol/L KH2PO4溶液,pH6.0；流速為0.6mL/min；柱溫為35℃；檢測器:示差檢測器。

1.2.3 紫外掃描圖掃描 稱取梭柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ24mg,將其配制成4mL的多糖溶液,以蒸餾水為對照,于190～500nm處掃描。

1.2.4 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[9]

1.2.5 淀粉的測定 采用碘-碘化鉀法[10]

1.2.6 糖醛酸的測定 采用硫酸-咔唑法[11]

1.2.7 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍G-250法[12]

1.2.8 紅外光譜掃描 取梭柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ2約2mg與KBr混合研細后,在4000～500cm-1范圍內進行紅外掃描[13-14]。

1.2.9 單糖組成分析 多糖CVP-Ⅱ2的水解:取柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ2TAPⅠ10mg,置于5mL安培管中,加4mL 2mol/L三氟乙酸,酒精噴燈封口,110℃水解6h,將水解液減壓蒸干,然后加甲醇溶解,再減壓蒸干,重復多次以除盡殘余的三氟乙酸[15-16]。

水解物的衍生化:分別向水解物、單糖標準品中加入鹽酸羥胺10mg、吡啶1mL,90℃水浴反應30min并振蕩,冷卻至室溫,加入醋酸酐1mL,繼續于90℃水浴保持30min,生成具有揮發性的糖腈乙酸酯衍生物。

氣相色譜分析:將按照上述方法制備的產物進行氣相色譜分析,根據匹配單糖標準品的保留時間分析結果,并根據氣相色譜各峰的面積比計算出單糖重量百分比[4-5]。色譜條件:采用Aglient 6890N氣相色譜儀、DB-1701毛細管柱(30m×0.25m,0.25μm)及氫火焰離子化檢測器；高純氮作載氣,流速為1mL/min。程序升溫:柱初始溫度為180℃,以2℃/min升至220℃,保持1min,以5℃/min升至250℃,保持2min；進樣口溫度為250℃,汽化室溫度為250℃,檢測器溫度為300℃,吹掃流速為4.0mL/min。

1.3 數據分析

用Microsoft Excel和Oringe軟件進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 CVP-Ⅱ2純度鑒定及其相對分子質量測定

梭柄松苞菇多糖經DEAE-52離子交換柱層析,以0.05mol/L的NaCl溶液洗脫得到CVP-Ⅱ,得率為30.00%,該組分經Sephadex G-100凝膠柱層析用蒸餾水洗脫,得到組分CVP-Ⅱ2,得率為12%。圖1為梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2經Sephadex G-100凝膠柱層析用蒸餾水洗脫,苯酚硫酸法跟蹤檢測得到CVP-Ⅱ2的洗脫曲線,只出現單一對稱峰,初步判定CVP-Ⅱ2為均一多糖。

圖1 得到CVP-Ⅱ2的葡聚糖凝膠 Sephadex G-100洗脫曲線 Fig.1 Elution curve of CVP-Ⅱ2 on Sephadex G-100 chromatography

圖2為梭柄松苞菇子實體多糖CVP-Ⅱ2的GPC圖譜。由圖2可知,CVP-Ⅱ2經凝膠滲透色譜得到的是單一對稱峰,與葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層洗結果一致,所以CVP-Ⅱ2為單一組分。CVP-Ⅱ2峰位分子量為6935u,數均相對分子量為Mn為9201u,重均相對分子量Mw為11252u,Z均相對分子量為13947u,分散系數為1.24。

圖2 CVP-Ⅱ2的GPC圖譜Fig.2 Gel chromatogram of CVP-Ⅱ2

2.2 CVP-Ⅱ2紫外光譜掃描

圖3為CVP-Ⅱ2紫外掃描光譜圖。由圖3可知,CVP-Ⅱ2在260、280nm處均沒有明顯特征吸收峰,說明CVP-Ⅱ2中不含蛋白質及核酸,或者兩種組分含量很少。

圖3 CVP-Ⅱ2的紫外掃描光譜圖Fig.3 UV spectrum of CVP-Ⅱ2

2.3 CVP-Ⅱ2理化性質分析

由表1可知,CVP-Ⅱ2為白色棉絮狀,不發生碘-碘化鉀反應,屬于非淀粉多糖；苯酚-硫酸法葡萄糖標準曲線為y=7.4491x-0.0044,R2=0.9994,測得總糖含量為86.76%,考馬斯亮藍G-250標準曲線方程為y=6.0659x+0.0359,R2=0.9922,測得的結果為反應呈陰性,結合紫外掃描光譜圖,CVP-Ⅱ2中不含蛋白,硫酸-咔唑反應呈陽性,且測得糖醛酸含量為12.93%。

2.4 CVP-Ⅱ2的紅外掃描光譜

圖4為梭柄松苞菇純化多糖CVP-Ⅱ2的紅外光譜圖。由圖4可知,CVP-Ⅱ2在波數3396cm-1處的強吸收峰是糖類分子間或分子內的O-H伸縮振動峰,在波數2927cm-1處存在的吸收峰為次甲基或甲基的C-H振動吸收峰,在波數1420、1364、1280cm-1處的吸收峰為羧基的C-O伸縮振動峰,這三組糖類的特征峰可以判斷CVP-Ⅱ2為多糖[13-14]；在波長1643cm-1處明顯吸收峰是羰基C=O的伸縮振動峰,加之1200～1000cm-1的C-O伸縮振動,再次印證CVP-Ⅱ2中含有糖醛酸,同時與2.3中所測得的結果一致,說明CVP-Ⅱ2是一種酸性雜多糖[13-14]；同時,在1200～1000cm-1的幾組吸收峰及917、764cm-1處的吸收峰表示CVP-Ⅱ2的糖環構型為吡喃型。

表1 CVP-Ⅱ2的理化性質Table 1 The physio-chemical properties of CVP-Ⅱ2

注:“-”表示未檢測出。

圖4 CVP-Ⅱ2的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum diagram of CVP-Ⅱ2

2.5 CVP-Ⅱ2的單糖組成分析

圖5為單糖標準品糖腈乙酸酯衍生化后的氣相色譜圖。由圖5可知鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的保留時間依次為8.667、9.674、10.012、10.795、16.087、17.207、18.010min。

圖5 各標準品的GC色譜圖Fig.5 GC diagram of standard mixture

圖6為CVP-Ⅱ2經糖腈乙酸酯衍生化后進行氣相色譜分析。將CVP-Ⅱ2的水解產物的氣相色譜圖各單糖的保留時間與單糖標準品保留時間進行對比,可知CVP-Ⅱ2含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。依據面積歸一化法,峰面積之比等于所含物質質量之比,可得出各個單糖質量百分比大致為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.48∶29.36∶5.02,根據各物質的質量與其摩爾質量之比得到的即為各物質的物質的量,即得到各單糖的物質的量之比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02。可見CVP-Ⅱ2中甘露糖含量最少,占2.71%；其次是巖藻糖和半乳糖,葡萄糖含量最高,占總質量的79.65%。

圖6 CVP-Ⅱ2GC色譜圖Fig.6 GC diagram of CVP-Ⅱ2

3 結論與討論

經采用超聲輔助水提,經脫色、脫蛋白、DEAE-52離子交換柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2,高效凝膠滲透色譜(GPC)和葡聚糖凝膠Sephadex G-100鑒定CVP-Ⅱ2為均一多糖,其重均相對分子量Mw為11252u；其狀態及顏色為白色棉絮狀,碘-碘化鉀反應呈陰性,證明不含淀粉,苯酚-硫酸法測得其總糖含量為86.76%,考馬斯亮藍G-250法及紫外掃描光譜分析顯示CVP-Ⅱ2不含蛋白,硫酸-咔唑法顯示其糖醛酸含量為12.93%；紅外光譜分析顯示為CVP-Ⅱ2含有多糖的特征吸收峰,且為吡喃型糖環構型；單糖組成分析顯示CVP-Ⅱ2由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖四種單糖組成,且其摩爾比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02。CVP-Ⅱ2主要由葡萄糖組成,質量占79.65%。

[1]戴玉成,周麗偉,楊祝良,等.中國食用菌名錄[J].菌物學報,2010,29(1):1-21.

[2]高秀君,閆培生,史翠娟,等.梭柄松苞菇ACE抑制活性研究[C].2010年中國菌物學會學術年會論文摘要集,2010.

[3]Liu YT,Sun J,Luo ZY,etal. Chemical composition of five wild edible mushrooms collected from Southwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity[J]. Food and Chemical Toxicology,2012,(50):1238-1244.

[4]Liu YT,Sun J,Rao SQ,etal. Antidiabetic activity of mycelia selenium-polysaccharide fromCatathelasmaventricosumin STZ-induced diabetic mice[J].Food Chem Toxicol,2013,62:285-291.

[5]Liu YT,Sun J,Rao SQ,etal.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic and antioxidant activities of polysaccharides fromCatathelasmaventricosumin streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Food Chem Toxicol,2013,57:39-45.

[6]劉蒙蒙,孫麗平,莊永亮.梭柄松苞菇子實體中多糖組分及體外抗氧化活性分析[J].食品工業科技,2013,34(21):72-77.

[7]李張,陳潔,汪淼,等.梭柄松苞菇多糖組分的部分理化性質及對S-180瘤抑制活性研究[J].微生物學通報,2013,40(12):2271-2279.

[8]周海華.云芝多糖超聲輔助提取及抗氧化[D].鎮江:江蘇大學,2007.

[9]董群,鄭麗伊,方積年.改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究[J].中國藥學雜志,1996,31(9):550-553.

[10]劉瑩,趙杰.褐蘑菇多糖的理化性質初步研究[J].湖北農業科學,2012,51(5):981-982.

[11]王文平,郭祀遠,李琳,等.野木瓜多糖中糖醛酸含量測定[J].食品科技,2007,10:84-86.

[12]王文平,郭祀遠,李琳,等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量[J].食品研究與開發,2008,29(10):115-117.

[13]查春節,唐永富,林麗靜,等.一種龍眼多糖分離純化與結構分析[J].廣東化工,2013,40(7):176-177.

[14]周本宏,楊蘭,袁怡,等.天麻中一種酸性雜多糖的分離純化和結構鑒定[J].中國醫院藥學雜志,2009,29(23):2002-2006.

[15]周躍斌,周向榮,王偉.毛竹葉水溶性多糖BPS1-1的色譜研究[J].食品科學,2008,29(8):184-187.

[16]李全陽,夏文水,徐德平.一種乳酸菌胞外多糖糖鏈結構解析[J].高等學校化學學報,2007,28(4):655-657.

Physico-chemical and structural characterization ofpolysaccharide CVP-Ⅱ2fromCatathelasmaventricosum

GAO Cheng-lin,ZHANG Xiao-shuang,CHEN Jian

(College of Light Industry and Food Science South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Polysaccaride CVP-Ⅱ2fromCatathelasmaventricosumfruiting bodies was extracted by water with ultrasonic-assisted and alcohol precipitating,and then was purified by decoloration,deproteinization with sevage method and DEAE-52 ion-exchange column choromatography and Sephadex G-100 column choromatography. It was identified as homogeneous component by means of gel permeation chromatography and Sephadex G-100 gel column chromatography. The contents of total sugar,protein,uronic acid and starch were determined by phenol-sulphuric acid,Coomassie brilliant blue staining,Sulfuric acid-carbazole method,law of iodine-potassium iodide. Its structure was analyzed by the method of IR,GC. The result showed that the weight average relative molecular mass of CVP-Ⅱ2was 11252u relatively. It was white and flocculent appearance with no starch. The contents of total sugar,protein,uronic acid was 86.76%,0,12.93%,respectively,CVP-Ⅱ2contained the characteristic absorption peak of polysaccharide and configuration was Pyran type,Monosaccharide composition of CVP-Ⅱ2was fucose,mannose,glucose and galactoside,and the mole ratios was:Man∶Fuc∶Glu∶Gla=1∶1.63∶29.36∶5.02.

Catathelasmaventricosum;polysaccaride;isolation and purification;structure

2014-05-04

高呈琳(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向:天然產物分離純化。

*通訊作者:陳健(1967-),男,博士,副教授,主要從事食品化學,天然產物化學,多糖生物技術等方面的研究。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.019