微波輔助提取垂絲海棠花中多糖及其抗氧化研究

衛(wèi) 強(qiáng),江敦清,紀(jì)小影,邱 鎮(zhèn),徐 飛

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽合肥 230088)

微波輔助提取垂絲海棠花中多糖及其抗氧化研究

衛(wèi) 強(qiáng),江敦清,紀(jì)小影,邱 鎮(zhèn),徐 飛

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽合肥 230088)

目的:優(yōu)化垂絲海棠花中多糖的微波提取工藝。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,研究提取時(shí)間、微波功率、料液比對(duì)垂絲海棠花中多糖含量的影響,確立最佳提取工藝。同時(shí),以DPPH自由基清除能力、還原Fe3+能力、清除·OH能力為指標(biāo)研究垂絲海棠花多糖的抗氧化活性。結(jié)果:垂絲海棠花中多糖的最佳提取工藝為:微波提取時(shí)間15min,液料比30∶1(g/g),微波功率3kW。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在達(dá)到最大濃度0.96mg/mL時(shí),垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)對(duì)DPPH自由基的清除率依次為69.8%、59.5%,垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)對(duì)·OH自由基的清除率依次為80.1%、58.2%,對(duì)還原Fe3+能力較強(qiáng)。顯示垂絲海棠花多糖有一定抗氧化活性,且垂絲海棠花多糖(微波)較垂絲海棠花多糖(煮沸)活性強(qiáng)。結(jié)論:微波提取垂絲海棠花中多糖較常規(guī)提取效率高,時(shí)間短,且抗氧化活性強(qiáng)。

垂絲海棠花,多糖,微波提取,Box-Behnken設(shè)計(jì),抗氧化

海棠為薔薇科蘋(píng)果屬觀賞植物,其種類(lèi)有西府海棠(Malusmicromalus)、垂絲海棠(M.halliana)、楸子(M.prunifolia)、湖北海棠(M.hupehensis)、三葉海棠(M.sieboldii)等,因其花、果有觀賞價(jià)值、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)而在園林景觀中被廣泛應(yīng)用[1]。垂絲海棠(M.hallianakoehne)廣泛分布于我國(guó)華東及西南地區(qū),安徽及我國(guó)各地均有栽培。其花入藥能調(diào)經(jīng)和藥,治崩漏[2]。

人類(lèi)各種疾病中,90%以上起源于活性氧和氧化應(yīng)激而體內(nèi)過(guò)多的氧自由基則對(duì)人體健康有破壞行為,可導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損傷,引起多種疾病,如炎癥、輻射損傷、腫瘤、帕金森病、老年癡呆癥和心臟病等[3-4]。多糖具有廣泛的生物活性,而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者已通過(guò)實(shí)驗(yàn),證明垂絲等7種常見(jiàn)觀賞海棠果實(shí)提取物的多酚和黃酮類(lèi)成分具有較強(qiáng)的抗氧化作用[6]。本文對(duì)垂絲海棠花中多糖類(lèi)成分進(jìn)行微波提取,并對(duì)其多糖成分抗氧化進(jìn)行初步研究,以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用其豐富的資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

垂絲海棠花采自合肥植物園,經(jīng)我院慶兆老師鑒定為薔薇科蘋(píng)果屬垂絲海棠(Malushallianakoehne)的花。葡萄糖及其它試劑均為分析純,水為純化水。

LDZ4-1.2型低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；CNWB-C型微波萃取器 廣州萬(wàn)程微波設(shè)備有限公司；UV-4802型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 垂絲海棠花(5g)→干燥,粉碎→垂絲海棠花粗粉→依次以石油醚、90%乙醇、60%乙醇超聲提取→抽濾,棄去濾液,殘?jiān)铀晕⒉ń帷鷿饪s→離心→Sevag法除蛋白→垂絲海棠花粗多糖→測(cè)定含量

1.2.2 提取方式 選取微波功率、提取時(shí)間、水與垂絲海棠花的質(zhì)量比(簡(jiǎn)稱(chēng)液料比,g/g)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察,選取提取時(shí)間、液料比、微波功率三個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以響應(yīng)面法分析最佳工藝。其因素、水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodolog

1.2.3 多糖含量測(cè)定 精密稱(chēng)取0.5g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中,以水溶解定容得到濃度為0.25mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取 0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10mL具塞試管中,加蒸餾水至 2.0mL,取蒸餾水2.0mL為空白對(duì)照,加入5%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速加入濃 H2SO45mL,室溫放置5min,再于沸水浴中恒溫15min。取出,迅速置于冰水中維持10min,在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值[7]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算含量。

垂絲海棠花多糖含量(mg/g)=粗多糖質(zhì)量/垂絲海棠花質(zhì)量

1.2.4 清除DPPH自由基能力 精密稱(chēng)定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)化合物0.0192g,以甲醇溶解,移入250mL容量瓶,得到濃度為0.2mmol/mL的溶液,冰箱冷藏,備用。

分別精密稱(chēng)定垂絲海棠花多糖0.05g,以90%乙醇溶解,定容至25mL,再稀釋至5組不同濃度的溶液(mg/mL),分別取1mL稀釋液,加入1mL上述濃度為0.2mmol/mL的DPPH溶液,以90%乙醇為空白,避光反應(yīng)30min,于波長(zhǎng)517nm下測(cè)定吸收度[8],以下列公式計(jì)算清除率(SA1)

其中:Aa表示樣品溶液吸收度值；Ab表示空白對(duì)照組吸收度值；A0表示對(duì)照組吸收度值。

1.2.5 還原Fe3+能力 采用普魯士蘭法測(cè)定樣品還原Fe3+能力。取10mL具塞比色管,依次加入不同濃度的垂絲海棠花多糖溶液2.0mL,磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH6.6)2mL和1%的鐵氰化鉀2mL,搖勻,于50℃水浴中反應(yīng)20min,加入10%三氯乙酸2.0mL,搖勻,離心10min(2500r/min),取上清液2.0mL,加入2.0mL蒸餾水和1%的三氯化鐵1.0mL,以空白試劑為對(duì)照,在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度值[9]。

1.2.6 清除·OH自由基能力 參考文獻(xiàn)[9]，利用H2O2與Fe2+產(chǎn)生·OH,·OH進(jìn)一步與水楊酸反應(yīng),產(chǎn)生有色產(chǎn)物,該有色成分在510nm波長(zhǎng)處有吸收。

固定反應(yīng)時(shí)間,取相同體積的反應(yīng)體系溶液(8.8mmol/LH2O21mL,9mmol/LFe2+1mL,9mmol/L水楊酸乙醇溶液1mL),加入不同濃度的垂絲海棠花多糖溶液,以蒸餾水為參比,與空白試劑作比較,于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度值,以下列公式計(jì)算清除率(SA2)

其中:Ax表示樣品溶液吸收度值；A0表示空白對(duì)照組吸收度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 垂絲海棠多糖提取采用Design-Expert8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì),組間數(shù)據(jù)進(jìn)行Cochran&Cox近似t檢驗(yàn),p<0.01表示極顯著,p<0.05表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間多糖含量的影響 設(shè)定水與垂絲海棠花的液固質(zhì)量比為20∶1,微波功率為3kW,研究不同提取時(shí)間(5、10、15、20、30、40min)對(duì)垂絲海棠花多糖含量的影響,結(jié)果微波提取時(shí)間以10～20min含量增加明顯,20min之后含量增長(zhǎng)緩慢。見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響Fig.1 Effect of extracting time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 微波功率對(duì)多糖含量的影響 固定水與垂絲海棠花粉的液固質(zhì)量比20∶1,提取時(shí)間10min,研究不同微波功率(0.5,1,2,3,4,5kW)對(duì)多糖含量的影響,結(jié)果微波功率以2～4kW含量較高,見(jiàn)圖2。

圖2 微波功率對(duì)多糖含量的影響Fig.2 Effect of microwave power on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 液料比對(duì)多糖含量的影響 固定提取時(shí)間10min,微波功率為3kW,研究不同液料比對(duì)多糖含量的影響。結(jié)果液料比(5∶1,10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,g/g)以20∶1～40∶1時(shí)含量較高。見(jiàn)圖3。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

圖3 液料比對(duì)多糖含量的影響Fig.3 Effect of the ratio between solvent and material on the extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以A、B、C為自變量,以垂絲海棠花中多糖含量為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。以Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,見(jiàn)表3。

由表3可知,提取時(shí)間,提取時(shí)間等三個(gè)因素的二次項(xiàng),提取時(shí)間與料液比交互項(xiàng)p值均小于0.01,說(shuō)明對(duì)含量的影響極顯著,對(duì)多糖含量有顯著性影響。失擬項(xiàng)檢驗(yàn)(lack of fit)p值顯示不顯著,表明模型充分?jǐn)M合,受其他因素影響小。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface methodology and the results of the experiments

經(jīng)顯著性檢驗(yàn),該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9981,說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好,自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著。得到如下回歸方程:

R1=26.94+0.79A+0.19B+0.12C-0.20AB+0.22AC-0.68BC-0.89A2-0.82B2-0.81C2

根據(jù)回歸分析結(jié)果,作出相應(yīng)曲面圖,如圖4所示。從響應(yīng)面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。

圖4 各兩因素交互作用對(duì)垂絲海棠花中 多糖提取的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface for the interactions on the extraction yield of polysaccharide from the flowers in Malus halliana koehne

根據(jù)回歸分析結(jié)果,作出相應(yīng)曲面圖,如圖4所示。三組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間曲面圖及其在二維平面上的等高線圖,響應(yīng)面可直觀反映三個(gè)因素之間及兩者之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[10]。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[11]。結(jié)合表3的p檢驗(yàn)值,由圖4a可知,液料比和提取時(shí)間交互作用為極顯著水平(p<0.01),等高線橢圓形；當(dāng)微波功率固定,隨著液料比和提取時(shí)間的增加,多糖含量呈現(xiàn)先快速提高后快速減小的趨勢(shì),提取時(shí)間對(duì)多糖含量呈現(xiàn)較明顯的影響。從等高線上看,提取時(shí)間在18min,液料比在30∶1附近值對(duì)提高含量有重要影響。由圖4b可知,微波功率和提取時(shí)間交互作用為極顯著水平(p<0.01),等高線橢圓形；當(dāng)液料比固定,隨著微波功率和提取時(shí)間的增加,多糖含量呈現(xiàn)先快速提高后快速減小的趨勢(shì),提取時(shí)間對(duì)多糖含量呈現(xiàn)較明顯的影響。從等高線上看,微波功率在3kW,提取時(shí)間15min附近值對(duì)提高含量有重要影響。由圖4c可知,微波功率和液料比交互作用為極顯著水平(p<0.01),等高線橢圓形；當(dāng)提取時(shí)間固定,隨著微波功率和液料比兩個(gè)因素的增加,多糖含量呈現(xiàn)先快速提高后緩慢減小的趨勢(shì),表明當(dāng)微波功率3kW,液料比30∶1附近值對(duì)多糖含量影響相對(duì)較小。

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)及提取方法比較 對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析,垂絲海棠花多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為:提取時(shí)間15min,液料比30∶1,微波功率3kW,此最優(yōu)工藝下垂絲海棠花粗多糖含量理論值為27.94mg/g。采用優(yōu)化提取條件進(jìn)行多糖的工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得垂絲海棠花多糖平均含量為27.78mg/g(n=3,RSD=1.28%),與理論預(yù)測(cè)值相比,相對(duì)誤差較小。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)摸索,稱(chēng)取藥材5g,以水煮沸提取3次(2,1,0.5h),液料比為30∶1。同時(shí)稱(chēng)取藥材5g,以微波最佳工藝進(jìn)行提取。兩種提取液經(jīng)1.2.1純化,分別得到水煮沸法提取多糖[以下簡(jiǎn)稱(chēng)“垂絲海棠花多糖(煮沸)”]和微波提取多糖[以下簡(jiǎn)稱(chēng)“垂絲海棠花多糖(微波)”],按照1.2.3項(xiàng)下測(cè)定含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同提取方法下的垂絲海棠花多糖含量比較(n=3)Table 4 Comparison of polysaccharide determination in two different extracting methods(n=3)

由表4可知,微波3次提取的垂絲海棠花多糖平均含量為63.16mg/g,與傳統(tǒng)的水煮沸法提取相比,具有時(shí)間短、提取效率高的特點(diǎn)。

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH的自由基清除能力 以維生素C(VC)為對(duì)照,建立對(duì)DPPH的自由基清除率與濃度的回歸方程,根據(jù)回歸方程計(jì)算清除率50%時(shí)的樣品濃度,結(jié)果見(jiàn)表5和圖5所示。

表5 垂絲海棠花多糖對(duì)DPPH的自由基清除能力Table 5 DPPH scavenging activity of polysaccharide from the flowers of Malus halliana koehne

注:垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)與VC相比,bp<0.01；垂絲海棠花多糖(微波)與垂絲海棠花多糖(煮沸)相比,ΔΔp<0.01。

表6 垂絲海棠花多糖對(duì)·OH自由基清除能力Table 6 ·OH scavenging activity of polysaccharide from the flowers of Malus halliana koehne

圖5 垂絲海棠花多糖對(duì)DPPH的自由基清除能力Fig.5 DPPH scavenging activity of polysaccharide from the flowers of Malus halliana koehne

注:垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)與VC相比,ap<0.05,bp<0.01；垂絲海棠花多糖(微波)與垂絲海棠花多糖(煮沸)相比,Δp<0.05。 由表5可知,以DPPH的自由基清除能力進(jìn)行比較,垂絲海棠花多糖(微波、煮沸)比VC對(duì)強(qiáng),有極顯著性差異(p<0.01)；垂絲海棠花多糖(微波)較垂絲海棠花多糖(煮沸)強(qiáng),有極顯著性差異(p<0.01)。由圖5可知,隨著垂絲海棠花多糖和VC濃度的增加,對(duì)DPPH的清除能力逐步增強(qiáng)。從整體的清除率來(lái)看,垂絲海棠花多糖(微波)最高,垂絲海棠花多糖(煮沸)和VC次之。在達(dá)到最大濃度0.96mg/mL時(shí),垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)和VC的對(duì)DPPH的清除率依次為69.8%,59.5%,54.6%。

2.3.2 不同提取工藝的還原Fe3+能力比較 結(jié)果見(jiàn)圖6所示。

圖6 垂絲海棠花多糖Fe3+還原能力Fig.6 Fe3+ reduction activity of polysaccharide from the flowers of Malus halliana koehne

由圖6可以看出,隨著垂絲海棠花多糖濃度增大,其吸光度值增加,對(duì)Fe3+還原能力增強(qiáng)。但是,從整體吸收度增加值來(lái)說(shuō),垂絲海棠花多糖(微波)較垂絲海棠花多糖(煮沸)具有更高的還原能力。與VC相比,在濃度0.64mg/mL前后,垂絲海棠花多糖(煮沸)呈現(xiàn)先強(qiáng)后弱的趨勢(shì)。

2.3.3 不同提取工藝的清除·OH自由基能力比較 結(jié)果見(jiàn)表6和圖7所示。

圖7 垂絲海棠花多糖清除·OH自由基能力Fig.7 ·OH scavenging activity of polysaccharide from the flowers of Malus halliana koehne

由表6可知,比較清除·OH自由基能力,垂絲海棠花多糖(微波、煮沸)比VC對(duì)強(qiáng),有極顯著性或顯著性差異(p<0.01或p<0.05)；垂絲海棠花多糖(微波)較垂絲海棠花多糖(煮沸)強(qiáng),有顯著性差異(p<0.05)。由圖7可看出,垂絲海棠花多糖清除·OH能力強(qiáng)于VC。隨著垂絲海棠花多糖濃度的增加,清除·OH自由基能力也逐步增強(qiáng),在達(dá)到最大濃度0.96mg/mL時(shí),垂絲海棠花多糖(微波)、垂絲海棠花多糖(煮沸)對(duì)·OH自由基的清除率依次為80.1%,58.2%。但是,從整體清除率增加的平均值來(lái)說(shuō),垂絲海棠花多糖(微波)較垂絲海棠花多糖(煮沸)具有更高的清除·OH自由基能力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以微波提取垂絲海棠花中多糖,可發(fā)揮微波的瞬間破壁能力,具有提速、增效的優(yōu)點(diǎn),得到的最佳工藝為:微波提取時(shí)間15min,液料比30∶1(g/g),微波功率3kW,得到垂絲海棠花多糖平均含量為26.78mg/g。根據(jù)多糖抗氧化研究結(jié)果,與常規(guī)煮沸法進(jìn)行比較,顯示垂絲海棠花中多糖具有明顯的抗氧化活性作用,且微波提取比煮沸提取得到的活性更強(qiáng)。其原因可能是由于多糖經(jīng)過(guò)煮沸法提取后,高溫破壞結(jié)構(gòu),致使其活性降低所致。但是,限于本實(shí)驗(yàn)為體外抗氧化研究,尚未闡明其抗氧化機(jī)制,有待進(jìn)一步探索和研究。

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Study on microwave-assisted extraction process ofpolysaccharides and antioxidant activities fromMalushallianakoehne

WEI Qiang,JIANG Dun-qing,JI Xiao-ying,QIU Zhen,XU Fei

(Pharmacology college,Anhui XinHua University,Hefei 230088,China)

Objective:To select the optimized microwave-assisted extraction process of polysaccharides and inspect its antioxidant activities fromMalushallianakoehne.Method:Based on single-factor experiments,Box-Behnken design and its response surface analysis,main factors of affecting polysaccharides yield such as extraction time,power of microwave,the ratio between solvent and material were studied to find the optimal process. Then,the DPPH· scavenging activity,Fe3+reduction activity,·OH scavenging activity of polysaccharides were studied to inspect its antioxidant activities. Result:The best extraction process was as follows:30 times of water,extracting 15min by 3kW power of microwave. When polysaccharides reached the concentration of 0.96mg/mL,the DPPH clearance rat of polysaccharides(extracted by microwave),polysaccharides(extracted by boiling method)was respectively 69.8%,59.5%. The clearance rat of free radical ·OH of polysaccharides extracted by microwave and boiling method was respectively 80.1% and 58.2%. Polysaccharides extracted by microwave had better Fe3+reduction activity. Conclusion:Compared with the traditional methods,microwave extraction method has high efficiency and makes the extracted polysaccharides more bioactive.

flowers ofMalushallianakoehne;polysaccharides;microwave-assisted extraction;Box-Behnken design Saccharides;antioxidant

2014-05-04

衛(wèi)強(qiáng)(1977-)，男，碩士，副教授，主要從事藥學(xué)教學(xué)與科研工作。

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201312216028，201312216029);安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目(2013gxk105)；安徽新華學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目(2013gxkcx01)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)03-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.020