金黃色葡萄球菌五種腸毒素基因PCRDHPLC檢測方法的建立

陳 彬,王 穎,鄭 晶,黃曉蓉,林 杰,彭華毅,邵碧英,*

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,福建福州 350001；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室,福建福州 350001；3.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

陳 彬1,2,王 穎1,3,鄭 晶1,2,黃曉蓉1,2,林 杰1,2,彭華毅1,2,邵碧英1,2,*

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,福建福州 350001；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室,福建福州 350001；3.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

本文設計合成了5種腸毒素基因的特異性引物,對PCR的退火溫度、DNA模板量進行優化,建立了5種腸毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶鏈式反應-變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)檢測方法,并測定方法的靈敏度和特異性。結果表明建立的PCR-DHPLC檢測方法的特異性很好,靈敏度可達到100cfu/mL。PCR-DHPLC方法具有快速、準確、高通量等優點,在進出口食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測上有很好的應用價值。

金黃色葡萄球菌,腸毒素,聚合酶鏈式反應(PCR),變性高效液相色譜(DHPLC)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是葡萄球菌屬的一種,在自然界中廣泛存在,主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉及頭發,有30%～80%的人群攜帶該病原菌[1-3],由其產生的腸毒素可通過污染食品而導致食物中毒。因此,該菌也是進出口食品中要求檢測的常見的微生物項目。傳統的金黃色葡萄球菌腸毒素基因型有5種,分別是SEA、SEB、SEC、SED和SEE[4]。人在進食攜帶該腸毒素污染的食物1～5h,會出現急性腸胃炎的癥狀,表現為惡心、嘔吐和腹瀉等。近年來,在中國發生的細菌性食物中毒病例中,由金黃色葡萄球菌引起的中毒事件占20%～25%,名列第四位[5-6],國際上已將葡萄球菌腸毒素的檢測列入食品檢驗法規。聚合酶鏈反應(PCR)技術具有快速、靈敏等特點,在葡萄球菌腸毒素基因的檢測上已有報道,但多采用凝膠電泳法檢測PCR產物,步驟繁瑣,易造成污染。變性高效液相色譜(DHPLC)是一種新型高通量篩選DNA序列的新技術,可用于PCR產物的快速分析。DHPLC具有全自動、高通量的特點,一次可同時分析數百個樣本。Franciosa等[7]、Hurtle等[8]與曹際娟等[9]均報道了利用DHPLC技術對細菌進行檢測的研究,

但尚未見將DHPLC技術應用于葡萄球菌腸毒素檢測的報道。本文選取金黃色葡萄球菌5種腸毒素基因,擬建立5種腸毒素基因的PCR-DHPLC檢測方法,為進出口食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的快速、高通量檢測提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌標準菌株共5株,分別是金黃色葡萄球菌產SEA菌(ICQQ22024)、金黃色葡萄球菌產SEC菌(ICQQ22028)、金黃色葡萄球菌產SED菌(ICQQ22003),中國檢驗檢疫科學研究院；金黃色葡萄球菌產SEB菌(F0137)和金黃色葡萄球菌產SEE菌(T43),本實驗室保存。

1.2 主要試劑與設備

dNTP、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker Ⅰ、細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；TEAA、DNA標樣 北京市表觀生物技術有限公司；變性高效液相色譜儀 美國Transgenomic公司。

1.3 引物

根據基因序列數據庫(GenBank)中收錄的5種葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)基因和特異基因femA的序列,并在美國生物技術信息中心(NCBI)上進行序列比對后篩選各自的特異性擴增片段,利用Primer5.0軟件設計引物,委托上海生工公司合成以下引物(表1)。引物用TE溶液(pH8.0)稀釋至濃度為10μmol/L,-20℃保存備用。

1.4 細菌DNA的提取

各取5株金黃色葡萄球菌標準菌株凍干粉,分別溶解于7.5% 氯化鈉肉湯中,于(36±1)℃培養18～24h,將培養物劃線接種到Baird-Parker平板,(36±1)℃培養18～24h。挑取平板上典型單菌落接種到5mL BHI培養液中,在臺式恒溫振蕩器(36±1)℃振蕩培養12h。取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接種于4mL營養肉湯,(36±1)℃培養18～24h。各取1mL菌懸液,按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA,經10倍稀釋后,于核酸蛋白儀上測定濃度和純度,并用TE溶液(pH8.0)稀釋至50ng/μL,-20℃保存備用。

1.5 PCR反應條件中退火溫度的優化

通常情況下,退火溫度為引物Tm值減5℃,也即55℃,表1所列的六對引物的Tm值平均在60℃,而且Taq DNA 聚合酶在50℃時效率最高,因此,選擇在55℃上下范圍內,進行退火溫度的優化。以常用的反應體系為基礎,使用梯度PCR儀對退火溫度進行優化。PCR反應體系:2×Taq PCR MasterMix 10μL,引物各0.5μL,DNA模板50ng,ddH2O 補至20μL。PCR擴增程序:94℃預變性5min；94℃變性40s,51～58℃退火40s,72℃延伸1min,35個循環；72℃延伸7min。PCR擴增結束后,取10μL PCR產物,經20mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測,選出最佳退火溫度。

1.6 PCR反應體系中DNA模板量的優化

以常用的反應體系為基礎,將模板DNA量分別設置為0、10、20、30、40、50、60、70ng共8個濃度梯度,用1.5中優化好的退火溫度進行PCR擴增。PCR擴增結束后,取10μL PCR產物電泳、成像拍照,篩選出最合適的模板DNA用量。

1.7 PCR-DHPLC檢測方法的建立

PCR反應體系、反應條件同1.5,取優化后的退火溫度與DNA模板量,參照1.5中的反應體系與反應條件進行PCR擴增。反應結束后,取5μL PCR產物進行DHPLC檢測。洗脫液由緩沖液A(0.1mol/L的TEAA,加250μL乙腈)及緩沖液B(0.1mol/L的TEAA,含25%的乙腈)組成,以0.9mL/min的流速在50℃柱溫下自動洗脫DNA分子,跑樣時間是20min,以標準分子量為參照,根據峰對應的堿基對大小判斷PCR產物是否正確。

1.8 PCR-DHPLC檢測方法的特異性測定

取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接種于4mL營養肉湯,36±1℃培養18～24h。各取1mL菌懸液,按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA。以金黃色葡萄球菌標準菌株的DNA作為陽性對照,以ddH2O作為空白對照,用建立的PCR-DHPLC方法檢測50株非金黃色葡萄球菌的腸毒素基因,以驗證該方法的特異性。

1.9 PCR-DHPLC檢測方法的靈敏度測定

接種金黃色葡萄球菌標準菌株于BHI培養液中,(36±1)℃搖床培養12h,將培養后菌懸液分別進行10倍系列稀釋,選擇合適的稀釋度,各吸取1mL稀釋液于菌落計數片中經培養后進行菌落計數。同時,各取1mL稀釋液,用試劑盒法提取DNA。DNA提取完畢,分別取2μL DNA模板按照上述確定的反應條件進行PCR擴增。反應結束后,取5μL PCR產物進行DHPLC檢測。

1.10 PCR-DHPLC檢測方法的實際應用

將建立的PCR-DHPLC檢測方法用于本實驗室近年來從食品樣品中分離到的金黃色葡萄球菌的檢測。吸取甘油保存的菌液50μL于BHI培養液,36±1℃搖床培養12h。吸取1mL菌懸液,12000r/min離心2min,棄上清。若沉淀太少,再取1mL菌懸液進行離心操作。用試劑盒法提取DNA,進行PCR-DHPLC檢測。

2 結果與分析

2.1 5對引物PCR退火溫度的優化結果

圖1 5對引物PCR擴增退火溫度的優化結果Fig.1 The optimization results of annealing temperature of five primers in PCR procedure注：M.DNA Marker I；A. SEA基因；B. SEB基因； C. SEC基因；D. SED基因；E. SEE基因； 1～8. 退火溫度分別為51、52、53、54、55、56、57、58℃。

分別對合成擴增5種腸毒素基因的5對引物的退火溫度進行優化,共選取了8個溫度,結果如圖1所示。隨著退火溫度的逐步升高,不同的引物目的條帶的亮度變化不同。對于SEA基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有增強；對于SEB基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有減弱；對于SEC基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有增強,但在51～54℃時,有雜帶的出現,而從55℃開始不再有雜帶；對于SED基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度差異不明顯；對于SEE基因,隨著溫度的升高,目的條帶的亮度稍有減弱趨勢。綜合考慮到既能保證各對引物都得到較好的擴增,又減少非特異條帶的產生,選取55℃為適宜的退火溫度。

2.2 DNA模板用量的優化結果

對DNA模板用量進行優化,電泳結果如圖2所示。隨著DNA模板用量的逐漸增加,5對引物的目的條帶的亮度變化程度相差不大。當DNA模板量為0時,沒有出現任何條帶,與預期結果相符；當DNA模板量從10ng到70ng逐漸增加時,預期目條帶的亮度逐漸變亮,但整體上條帶變亮的趨勢并不明顯。因此,從10ng到70ng均可作為合適的DNA模板用量。既能保證PCR有效擴增,又能節約DNA模板,因此選取居中的50ng為適宜的DNA模板用量。

圖2 DNA模板用量的優化結果Fig.2 The optimization results of DNA amount注：M.DNA Marker I；A.SEA基因；B.SEB基因； C.SEC基因；D.SED基因；E.SEE基因； 1～8.DNA模板的量分別為0、10、20、30、40、50、60、70ng。

表2 PCR-DHPLC檢測法特異性測定結果Table 2 The specific detection results of PCR-DHPLC method

注:“-”-無吸收峰出現。2.3 5種腸毒素基因的PCR-DHPLC檢測結果

本文除了5型腸毒素基因外,還增加了金黃色葡萄球菌特有的femA基因,以檢驗金黃色葡萄球菌DNA的提取效果、并避免出現假陰性結果。將femA基因和5種腸毒素基因分別進行PCR-DHPLC法檢測,圖譜的橫坐標表示出峰時間(min),各PCR產物均為單一峰,且堿基數多的出峰時間長,出峰位置與預期的吻合(圖3)。金黃色葡萄球菌特異基因femA基因峰(132bp)位于102bp峰和174bp峰之間,靠近102bp峰；產SEA標準菌株陽性峰(218bp)基本位于174bp峰和257bp峰的中間；產SEB標準菌株陽性峰(477bp)位于458bp峰和582bp峰之間,靠近458bp峰；產SEC標準菌株陽性峰(282bp)基本位于267bp峰和298bp峰之間；產SED標準菌株陽性峰(330bp)基本位于298bp峰和434bp峰之間,靠近298bp峰；產SEE標準菌株陽性峰(400bp)基本位于298bp峰和434bp峰之間,靠近434bp峰(圖8)。檢測結果表明經優化后建立的PCR-DHPLC檢測方法不僅適用于5種腸毒素基因,也適用于金黃色葡萄球菌特有的femA基因。

圖3 5種葡萄球菌腸毒素基因 及femA基因PCR-DHPLC檢測結果Fig.3 The PCR-DHPLC results of five enterotoxins genes and femA gene注1.Wave DNA sizing control(80、102、 174、257、267、298、434、458和587bp)； 2. SEA；3. SEB；4. SEC；5. SED；6. SEE；7.femA基因。

2.4 PCR-DHPLC法的特異性測定結果

用建立的PCR-DHPLC法檢測本實驗室保存的50株非金黃色葡萄球菌的標準株和分離株的特異性檢測結果見表2,測定的結果只有金黃色葡萄球菌標準菌株出現預期峰,而非目標菌株均未出現任何峰。以大腸埃希氏菌、沙門氏菌測定結果為例如圖4,只有金黃色葡萄球菌標準菌株擴增出了相應的目的條帶,而大腸埃希氏菌、沙門氏菌菌株以及ddH2O均沒有出現任何條帶。測定結果表明建立的PCR-DHPLC方法的特異性很好。

圖4 特異性實驗DHPLC觀察結果Fig.4 The specific experimental DHPLC results注:1.Wave DNA sizing control(80、102、174、 257、267、298、434、458、587bp)； 2.金黃色葡萄球菌標準菌株；3.ddH2O； 4.大腸埃希氏菌(ATCC 25922)；5.沙門氏菌(ATCC 13076)。

2.5 PCR-DHPLC法的靈敏度測定結果

5種葡萄球菌腸毒素PCR-DHPLC檢測靈敏度的測定結果如圖4所示。隨著菌含量的逐漸減少,DHPLC檢測結果顯示的特異峰面積越來越小。SEA最低能檢測到53cfu/mL,SEB能檢測到36cfu/mL,SEC能檢測到45cfu/mL,SED能檢測到32cfu/mL,SEE能檢測到41cfu/mL。即對于5種腸毒素基因,PCR-DHPLC的靈敏度均可達到100cfu/mL。

圖5 5種腸毒素基因PCR-DHPLC 檢測方法的靈敏度測定結果Fig.5 The sensitivity detection results of PCR-DHPLC method of five enterotoxins genes注：A. SEA；B. SEB；C. SEC；D. SED；E. SEE； 1. Wave DNA sizing control；A2～5分別為: 103、102、53、5cfu/mL；B2～5分別為: 103、102、36、3cfu/mL；C2～5分別為: 103、102、45、4cfu/mL；D2～5分別為: 103、102、32、3cfu/mL；E2～5分別為: 103、102、41、4cfu/mL。

2.6 PCR-DHPLC檢測方法的實際應用結果

將建立的PCR-DHPLC方法用于本實驗室近幾年從食品樣品中分離的金黃色葡萄球菌的檢測,共檢測了80株金黃色葡萄球菌,樣品菌株來源于多種食品樣品,主要有水產品:蝦、蟹、蜆子、干貝及各種魚類；肉及肉制品:牛肉和雞肉制品；果蔬類:冷凍菜、毛豆和食用菌；糧食及其制品等。檢測結果顯示,80株金黃色葡萄球菌中有47株含有腸毒素基因,陽性率為58.75%,腸毒素基因型分布情況見表3。只含1種腸毒素基因的有33株,其中只含SEA基因的有20株,只含SEB基因的有3株,只含SEC基因的有9株,只含SEE基因的有1株。同時含有2種腸毒素基因的有13株,其中含SEA、SEC基因的有4株,含SEA、SEE基因的有1株,含SEB、SEC基因的有7株,含SEC、SED基因的有1株。同時含有3種腸毒素基因(SEA、SEB和SEC)的菌株僅有1株。3 結論與討論

表3 80株金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布情況Table 3 The enterotoxin gene distribution of eighty strains Staphylococcus aureus

應用本文建立的PCR-DHPLC方法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素,從對樣品進行增菌,取增菌液提取DNA,到采用PCR-DHPLC方法檢測,只需2d時間就可出結果。而傳統的檢測方法采用細菌分離培養方法,對金黃色葡萄球菌的檢測就需3～6d,而且檢測靈敏度不高,易導致漏檢,如果對檢出的金黃色葡萄球菌是否產腸毒素還要花費數天以上時間,耗時更長。另外,本實驗應用DHPLC方法代替瓊脂糖凝膠電泳,不僅可以省掉點樣、電泳、染色和觀察等較為繁瑣的步驟,還可以避免接觸凝膠電泳中潛在的致癌物質-溴化乙錠,只需將PCR反應管放入自動進樣器,設定好程序,便能自動完成數百個樣品的檢測,在業務量大的情況下,該方法的應用,可達到高通量檢測的目的,而且大大縮短檢測周期。

本文以SEA～SEE為研究對象,建立的金黃色葡萄球菌腸毒素的PCR-DHPLC檢測方法,靈敏度高、特異性強,克服其它方法的局限性,達到快速、簡便、準確、高通量的目的。能夠應用于金黃色葡萄球菌腸毒素基因的檢測及分型,對預防和診斷由腸毒素引起的食物中毒,保障食品衛生安全具有十分重要的意義。

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Development of PCR-DHPLC detection method forfive types of Staphylococcal enterotoxin genes

CHEN Bin1,2,WANG Ying1,3,ZHENG Jing1,2,HUANG Xiao-rong1,2,LIN Jie1,2,PENG Hua-yi1,2,SHAO Bi-ying1,2,*

(1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fuzhou 350001,China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research,Fuzhou 350001,China；3.College of Food Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Five pairs of primers were designed and synthesized for five Staphylococcal enterotoxins genes(SEA,SEB,SEC,SED,SEE). The PCR-DHPLC detection methods for five Staphylococcal enterotoxins genes were established after optimizing of the annealing temperature and DNA template amount. The sensitivity and specificity of the detection method were then determined. The results showed that the PCR-DHPLC method could detect specifically of Staphylococcal enterotoxins genes with detection limit of 100cfu/mL. The PCR-DHPLC detection method had some advantages,such as rapid,accuracy and high throughput. The PCR-DHPLC method had fine application value to detecting Staphylococcal enterotoxins in import and export foods.

Staphylococcusaureus；enterotoxin；PCR；DHPLC

2014-04-29

陳彬(1969-)，女，學士，高級工程師，研究方向：食品微生物檢測。

*通訊作者:邵碧英(1973-)，女，博士，研究員，研究方向：食品微生物檢測。

福建省科技廳自然科學基金項目(2012J01062) ；福建局科技項目(FK2012-25)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.027