豆腐酸漿老湯中產酸菌的分離篩選與鑒定

喬支紅,李艷芳,許榮華,姜 慧,張 琦,修 宇

(1.北京聯合大學旅游學院,北京 100101;2.北京市食品及釀酒產品質量監督檢驗一站,北京 100075)

豆腐酸漿老湯中產酸菌的分離篩選與鑒定

喬支紅1,李艷芳2,許榮華1,姜 慧1,張 琦1,修 宇1

(1.北京聯合大學旅游學院,北京 100101;2.北京市食品及釀酒產品質量監督檢驗一站,北京 100075)

利用MRS選擇性培養基,從分別采自山東鄒平、陜西榆林、河北淶源、云南石屏、云南建水及云南元陽的6份酸漿老湯中分離純化出12種菌落形態不一樣的乳酸菌,分別采用MC改良培養基和發酵黃漿水pH及產酸量的監測對12種菌進行初篩及復篩,篩選出一株產酸較快、較高的乳酸菌,并對該菌株進行了菌落形態、生理生化及16S rDNA序列分析的鑒定實驗,結果表明:該菌株為革蘭氏陽性菌,菌落特征為白色,圓形,表面突起,不透明,邊緣整齊,鏡檢發現該菌為球菌、直徑為0.8μm,四聯或成串排列,經生理生化及16S rDNA序列鑒定確定該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌(Enterococcusfaecium),遺傳穩定性較好。

豆腐酸漿老湯,分離,鑒定,屎腸球菌

酸漿豆腐為我國民間傳統的一種豆腐制品,有上百年的歷史,它是以酸漿為凝固劑制作而成。其味道獨特,彈性較好,是農家樂豆腐宴中的極品,深得旅游者的喜愛[1]。在民間酸漿豆腐制作的調研中發現,酸漿豆腐的制作多為手工作坊,工業化生產的廠家幾乎沒有,其根本原因在于酸漿無法標準化生產,進而制約了酸漿豆腐的工業化生產。

農民制作豆腐所用的酸漿,是用酸漿老湯為“酵種”,再加入新的黃漿水放置一晚后酸化而成。如不加入酸漿老湯,其酸化速度較慢。而且發現,不同地方所制作的酸漿顏色、風味有所不同,酸漿豆腐的口感也略有不同。可見,老湯對于酸漿及酸漿豆腐的制作及風味有較大的影響。酸漿老湯為自然發酵而成,微生物種類繁多,不同的地理環境決定了老湯中優勢菌群的種類,優勢菌也較固定,進而影響酸漿及酸漿豆腐的質量。可以說,酸漿老湯中的優勢微生物是制作酸漿及酸漿豆腐的關鍵所在。若從酸漿老湯中將使酸漿變酸的主要微生物分離篩選出,純種發酵酸漿,即可將酸漿量化進行大規模的標準化生產,進而可完成酸漿豆腐的標準化生產,為我國民間酸漿豆腐的工業化生產提供有力的前提保證。目前,國內有關豆腐酸漿中微生物的篩選研究也有,然而,多數篩選的實驗材料為自制的黃漿水酸化后或點漿所用的酸漿[2-4],其微生物受環境影響較大。

本研究以采集的中國六個不同地方的酸漿老湯為試樣,分析不同地方酸漿老湯中乳酸菌的分布情況,利用乳酸菌選擇性培養基從中分離篩選產酸較多、遺傳穩定性較好的優勢乳酸菌種,并進行鑒定,為酸漿的標準化生產提供一株較好的生產菌種。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

黃漿水 北京道爾泰豆腐店提供；酸漿老湯 采自山東鄒平、河北淶源、陜西榆林、云南建水、云南石屏、云南元陽；培養基:黃漿水液體培養基(自制:黃漿水+2%葡萄糖121℃高壓滅菌)；MRS固體、液體培養基；改良MC固體培養基 北京藍弋化工產品有限責任公司；API 20 STREP乳酸菌生化鑒定試劑盒 梅里埃(中國)有限公司。

PHS-25酸度計 上海精密科學儀器公司；DHP-420BS電熱恒溫培養箱 天津市中環實驗電爐公司；ZDX-35BI(30L)滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SL602N電子天秤 上海民橋精密儀器公司；超聲波振蕩器,DH-101-OBS電熱鼓風干燥箱 天津市中環實驗電爐公司；SW-CJ-2FD超凈臺 上海博迅實業有限公司；YS100攝影生物顯微鏡 南京江南光電股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 增殖培養 取5mL酸漿老湯接種于20mL滅菌黃漿水液體培養基內,放入37℃恒溫培養箱靜置培養48h。

1.2.2 稀釋涂布 用滅菌生理鹽水將增殖培養后的菌液以十倍稀釋法稀釋到10-5、10-6、10-7三個稀釋度,每個稀釋度取菌液100μL,采用涂布平板法,分別涂布于MRS、改良MC兩種固體培養基上,涂布好的平板倒置放入37℃恒溫培養箱培養48h。

1.2.3 乳酸菌的分離純化 取出培養好的MRS培養基平板,在超凈臺上觀察。其中,MRS培養基中挑取菌落特征不同的菌種,并對不同菌落特征的菌計數,挑取單菌落在滅菌后MRS固體培養基上劃線分離2～3次,直至純菌并編號,分別于10倍放大鏡下進行菌落形態學觀察,挑取單菌落進行革蘭氏染色,于100倍光學顯微鏡下進行菌體形態觀察,并記錄。選取革蘭氏染色陽性菌接種于MRS斜面,于37℃恒溫培養箱培養48h后4℃保存,備用。

1.2.4 產酸菌種的初步篩選 分別將分離純化的12株革蘭氏陽性菌接種于MRS液體培養基中,于37℃恒溫培養箱靜置培養48h后,稀釋適當的稀釋度后涂布于改良MC培養基[5]中,于37℃恒溫培養箱培養48h,觀察是否有溶鈣圈,如有溶鈣圈初步判定為產酸菌株。于MRS斜面培養后4℃保存,備用。

1.2.5 產酸菌種的復篩 乳酸量的測定:將初步篩選出的具有溶鈣圈的5種純種菌株接入MRS液體培養基,恒溫培養24h后,用無菌生理鹽水以10倍稀釋法稀釋到10-6,涂布于MRS固體培養基上,并于37℃恒溫培養箱中培養24h,進行菌落計數。取含相同菌數的不同菌液分別接進裝有20mL滅菌新鮮黃漿水的試管中,每種菌接7支試管,于37℃的培養箱中靜置培養。分別在2、4、6、8、10、12、24h時取出一支試管測定試管內培養液的乳酸量。

乳酸含量測定用總酸測定方法[6],用標定后的NaOH溶液(約0.08mol/L)進行滴定測量,公式如下:

產酸量(以乳酸計)=c×(v1-v0)×k×F/v×100

式中:C-NaOH標準溶液的濃度,mol/L(約0.08mol/L)；V1-NaOH標準溶液在滴定待測樣時所消耗的體積,mL；V0-滴定黃漿水原樣消耗的標準NaOH,mL(約0.3mL)；V-待測樣的體積,mL；F-樣品稀釋倍數；K-換算為主要酸的系數,即1molNaOH相當于乳酸的克數,用乳酸計K=0.09。

黃漿水發酵液pH的測定:采用酸度計測定。

根據不同發酵時間下,菌種產酸能力的測定,篩選出產乳酸量高,發酵液pH下降快的菌株。

1.2.6 產酸菌的生理生化鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》[7]《常見細菌系統鑒定手冊》[8]中乳酸菌的生化鑒定實驗方法,利用API 20 STREP生化反應鑒定系統對復篩出的菌株進行生理生化特性實驗。

1.2.7 產酸菌的16S rDNA序列分析鑒定 將待檢菌株送于中國微生物菌種保藏管理中心進行16S rDNA序列測定,運用Clust X軟件校準排齊后,在GenBank 數據庫中進行BLAST同源性比對分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標準進行屬種歸類。然后再對待測菌株與模式菌株16S rDNA序列利用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹,進一步進行種屬鑒定。

1.2.8 遺傳穩定性的定性實驗 將待測菌株分別在液體培養基中傳代10次,取空白10mL,樣液10mL,用經過約0.01mol/L的鄰苯二甲酸氫鉀標準溶液標定的0.1 mol/L NaOH滴定,測定每一代的產酸情況,方法同1.2.5。判斷其遺傳性能的穩定性。

1.3 數據處理

數據折線圖采用Excel2007制作,數據統計采用SPSS 19.0進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(p<0.05),數值以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 分離出的12種不同菌種的菌落特征及菌體形態描述

經多次分離純化,從六個不同地方的酸漿老湯中獲得共12株菌落形態特征不一樣的菌種,通過革蘭氏染色實驗,12株菌均為革蘭氏陽性菌。利用顯微鏡觀察菌株的菌體形態特征,均與乳酸菌相符。結果如表1所示。

表1 12種乳酸菌菌落特征及菌體形態描述結果Table 1 The description of colony characteristics and mycelia morphology of 12 strains

2.2 六個不同地方酸漿老湯中乳酸菌的分布情況

對不同地區酸漿老湯中的不同菌種進行菌落計數,并進行統計分析,如圖1所示。

圖1 不同地方乳酸菌種分布情況Fig.1 The distribution of lactic acid bacterium in the different samples

自然環境對微生物的種類有較大的影響。從圖中,可以看到不同地方,由于自然環境不同,酸漿老湯中分布的乳酸菌種也有所不同,平均每個老湯樣品中有3～4種不同的乳酸菌；另外,也可以看到,同一菌種在不同地方中均有出現,如10號菌種在山東鄒平、云南建水、云南石屏及陜西榆林四個地方的酸漿老湯中均有分布,且該菌為優勢菌,說明該菌種具有發酵酸漿的共性。

2.3 產酸菌種的初篩結果

根據方法1.2.4對12株乳酸菌進行溶鈣圈實驗,由于改良的MC培養基中添加了CaCO3,所以隨著乳酸菌的生長,乳酸菌產生的酸會溶解培養基中的CaCO3,在菌落周圍形成透明圈。如圖2所示:

圖2 菌株溶鈣圈示意圖Fig.2 The soluble calcium circle

選取有溶鈣圈的菌株進入復篩,有溶鈣圈的菌株為3號、7號、9號、10號及11號菌。

2.4 產酸菌種的復篩結果

為比較各菌株的產酸能力,分析了3號、7號、9號、10號及11號乳酸菌在黃漿水發酵過程中產乳酸量及發酵液pH的變化,結果如圖3、圖4所示。

圖3 24h內發酵液乳酸量的變化Fig.3 Lactic acid production of fermented tofu whey in 24h

圖4 24h內發酵液pH的變化Fig.4 The pH values of fermented tofu whey

黃漿水中含有蛋白質、糖及微量礦物質、維生素等豐富的營養物質[9-10],乳酸菌可很好的生長繁殖。從圖3中可以看出,乳酸菌利用黃漿水中的糖發酵產生乳酸,隨時間的延長而呈上升的趨勢,相應的發酵液的pH呈逐漸下降的趨勢(如圖4所示)。不同乳酸菌在黃漿水中的生長速度不同,所產生的乳酸量的多少及發酵液pH下降速度有所不同,從圖3、圖4中可以看出,在同一發酵時間里,10號菌產生的乳酸量較其它菌種多,相應的發酵液的pH也較低,隨時間的延長,pH下降速度較快,直到發酵12h時,發酵液的pH達到3.51,發酵24h時達到3.26。六個地方所采集的酸漿老湯,pH平均為3.53,可見,10號菌具有較好的發酵性能,可作為酸漿標準化生產的優良發酵菌種。

表2 10號菌株遺傳穩定性測定Table 2 The stability of genetic

2.5 10號菌遺傳穩定性測定

將10號菌株分別在黃漿水液體培養基中傳代10次,測定每一代的產酸情況,結果如表2所示:

由表2中可知,10號菌株在液體培養基中連續傳代10代,乳酸產量基本保持不變,說明此菌株在液體培養基中遺傳穩定性較好,可作為酸漿老湯制作所用的發酵菌種。

2.6 10號菌菌種鑒定結果

2.6.1 菌落、菌體形態的鑒定結果 將10號菌株接種在MRS固體平板上37℃培養48h后,菌落呈圓形、表面突起,邊緣整齊,不透明,白色(如圖5所示)。對固體平板上的菌株進行革蘭氏染色,發現該菌體為球形,四聯或成串排列,直徑約為0.8μm(如圖6所示)。

圖5 10號菌在MRS培養基中的菌落形態Fig.5 Colony morphology of 10 on MRS

圖6 10號菌的菌體形態Fig.6 Cellular morphology of 10

2.6.2 10號菌生理生化的鑒定結果 對10號菌進行生理生化的常規鑒定實驗,發現10號菌表現為45℃生長,產生黃色素,發酵甘油產酸,水解馬尿酸,同時對照API 鑒定系統數據庫中的細菌編碼,可初步判斷10號菌為腸球菌屬,生理生化表型特征結果如表3所示:

表3 10號菌生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 10

2.6.3 10號菌分子生物學的鑒定結果 10號菌株16S rDNA的基因序列測序結果為:

圖7 10號菌株的16S rDNA的系統發育數Fig.7 16S rDNA phylogenetic tree of 10

將10號菌的序列提交GenBank,通過Blast程序與其中的核酸數據庫進行比對,結果表明與該序列相似度高的相關菌株均為腸球菌屬,系統發育分析得出該菌與EnterococcuslactisBT159T(GU983697)和EnterococcusfaeciumATCC 19434T(DQ411813)兩株菌在同一分支上,親緣關系最近,相似性達99.7%以上,再結合形態特征、生理生化特征,可以初步確定該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌。

3 結論

通過本研究,從六個不同來源的酸漿老湯中分離純化到12種菌落形態不同的乳酸菌株,并篩選出5株(3號、7號、9號、10號及11號)產酸的乳酸菌株,根據產酸能力的測定,最終篩選到1株產酸高且遺傳穩定性較好的乳酸菌種。經菌種鑒定,該菌為腸球菌屬中的屎腸球菌。將該菌種接種于滅菌的黃漿水中于37℃培養24h,可獲得pH為3.26的酸漿,與酸漿老湯的pH(3.5)相近,此酸漿經進一步實驗,可制作成酸漿豆腐。

今后可將此菌作為酸漿標準化生產的發酵菌種,為酸漿及酸漿豆腐的標準化生產提供了有力的保證。也可用于直接發酵豆漿,制作發酵豆腐[11-12]。

[1]喬支紅.乳酸菌發酵延長豆腐保質期及抑菌機理的研究[D].北京:中國農業大學,2008.

[2]尹向壟,惠明,田青.豆腐酸漿中一株解淀粉乳桿菌的分離鑒定[J].中國釀造,2012,31(4):95-98.

[3]于海峰,宋俊梅,劉慶軍，等.發酵大豆乳清的乳酸菌的分離篩選研究[J].食品科技,2004(4):93-95.

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[6]李啟隆,胡勁波主編.食品分析科學[M].北京:化學工業出版社,2010:50.

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Isolation and identification of acid-producing lacticacid bacteria from tofu acid whey

QIAO Zhi-hong1,LI Yan-fang2,XU Rong-hua1,JIANG Hui1,ZHANG Qi1,XIU Yu1

(1.Tourism Insititute of Beijing Union University,Beijing 100101,China；2.Beijing Municipal Food and Wine Products Quality Supervision and Inspection Station,Beijing 100075,China)

12 strains of lactic acid bacterium were isolated from 6 different tofu acid whey from Shandong zouping,Shanxi yulin,Hebei laiyuan,Yunnan shiping,Yunnan jianshui and Yunnan yuanyang by MRS selective medium. 12 strains of lactic acid bacterium were preliminary screed by MC selective medium. On the basis of the measurement of fermented tofu whey’s pH values and lactic acid production in different fermented time,the high acid producing strain was screened out. The identification tests of colony morphology,physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis were studied for the acid producing strain. The results showed that the strain was gram-positive,circular,white,surface convex,opaque,and entire. According to physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis,the strain was identified asEnterococcusfaecium.

tofu acid whey;isolation;identification;Enterococcusfaecium

2014-04-17

喬支紅(1976-)，女，博士，講師，研究方向：中國傳統大豆制品。

北京市教委科研計劃(81106991314)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.029