抑菌凝膠敷料的生物學(xué)評(píng)價(jià)

楊 帥，周新欽，黃 寧，劉 堯，朱天鋼

（河南南陽市匯博生物技術(shù)有限公司，河南南陽473000）

抑菌凝膠敷料的生物學(xué)評(píng)價(jià)

楊 帥，周新欽，黃 寧，劉 堯，朱天鋼

（河南南陽市匯博生物技術(shù)有限公司，河南南陽473000）

目的：對(duì)抑菌凝膠敷料進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。方法：進(jìn)行體外細(xì)胞毒試驗(yàn)以及皮膚刺激試驗(yàn)，并按照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。結(jié)果：在顯微鏡下觀察，L929細(xì)胞生長良好，細(xì)胞相對(duì)增殖率為90.5%，細(xì)胞毒性總評(píng)級(jí)為1級(jí)，極輕細(xì)胞毒性。刺激試驗(yàn)：產(chǎn)品材料等級(jí)評(píng)分為0，無刺激反應(yīng)。

抑菌凝膠敷料；細(xì)胞毒；皮膚刺激；生物學(xué)評(píng)價(jià)

人體皮膚是與外界環(huán)境接觸的天然屏障，但由于外界疾病因素和創(chuàng)傷等造成損害時(shí)，常常會(huì)引起水分、電解質(zhì)的丟失，開放性的創(chuàng)面往往還會(huì)引起感染［1］。在早期有效的封閉創(chuàng)面可以很好的減少細(xì)菌感染和并發(fā)癥的產(chǎn)生。抑菌凝膠敷料是南陽市匯博生物技術(shù)有限公司研發(fā)的一款產(chǎn)品，其主要成分是羥乙基纖維素、甘油和聚六亞甲基單胍鹽酸鹽，通過浸潤傷口覆蓋層來濕潤傷口，用于潰瘍、燒燙傷、術(shù)后等傷口護(hù)理。為了保證該凝膠敷料應(yīng)用于人體安全無毒副作用，我們按照國家相關(guān)技術(shù)要求對(duì)該款產(chǎn)品進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：CO2培養(yǎng)箱購自上海一恒，F(xiàn)C全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Thermo，AE2000倒置顯微鏡購自廈門麥克奧迪，抑菌凝膠敷料（南陽市匯博生物技術(shù)有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（以色列BI公司），胎牛血清（以色列BI公司），L929細(xì)胞（購自中科院上海生命科學(xué)院），成年新西蘭兔，質(zhì)量2.0～3.0kg，由章丘市金豐肉兔養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供［許可證號(hào)：SCXK（魯）2014-0006］，飼養(yǎng)條件為溫度22～24℃，濕度40%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)：依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886.5進(jìn)行［2］，實(shí)驗(yàn)一共分為4組：實(shí)驗(yàn)組，材料浸提液；空白對(duì)照組，DMEM高糖培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組，高密度聚乙烯；陽性對(duì)照組，5%的DMSO溶液。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化并加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)細(xì)胞／ml。試驗(yàn)步驟：將配制好的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板，每組各設(shè)6孔，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入5% DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)組加入試驗(yàn)樣品浸提液，每孔100 μl，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換培養(yǎng)液后的48 h，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20 μl質(zhì)量濃度為5 g／L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μl DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測定OD值（吸光度值），按下式計(jì)算相對(duì)增殖率（RGR）。

式中：RGR—相對(duì)增殖率，%；A—供試品組吸光度；A0—陰性對(duì)照組吸光度。

根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定（陽性對(duì)照組至少為3級(jí)反應(yīng)）。

樣品毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)≥100；1級(jí)，80～99；2級(jí)，50～79；3級(jí)，30～49；4級(jí)，0～29。樣品合格與否標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)和1級(jí)判為合格，2級(jí)結(jié)合形態(tài)分析綜合評(píng)價(jià)，3～4級(jí)者判為不合格：

1.2.2 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 16886.10進(jìn)行檢測［3］，實(shí)驗(yàn)分為兩組，樣品組：樣品和生理鹽水按照1∶5（w／w）在70℃下浸提24 h。陰性對(duì)照：同上方法制備不含被測樣品的0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照液。選用兩只新西蘭兔，實(shí)驗(yàn)前一天，徹底去除動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)被毛，以備注射浸提液。在每只兔脊柱一側(cè)的前5個(gè)點(diǎn)使用1 ml注射器皮內(nèi)注射0.2 ml的樣品浸提液，同樣，在每只兔脊柱后5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射生理鹽水。注射后在24 h、48 h和72 h觀察記錄各注射部位情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，細(xì)胞貼壁生長良好，數(shù)目正常。陽性對(duì)照組細(xì)胞變圓，脫離培養(yǎng)孔，呈現(xiàn)漂浮狀。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長良好，保持小鼠成纖維細(xì)胞的基本形態(tài)。空白對(duì)照和陰性對(duì)照組的平均吸光度值都是0.84，而陽性對(duì)照組只有0.18。實(shí)驗(yàn)組的增殖率為90.5%，按照細(xì)胞毒分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為1級(jí)，符合國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)觀察72 h表明，樣品浸提液組和生理鹽水組動(dòng)物皮膚反應(yīng)均無紅斑，水腫，產(chǎn)品材料等級(jí)評(píng)分為0，無刺激反應(yīng)，顯示材料對(duì)皮膚沒有潛在毒性。

3 討論

作為醫(yī)用高分子材料，除了要求無毒、不引起生物體病變，還要求材料對(duì)于生物體具有良好的組織相容性。羥乙基纖維素屬于纖維素衍生物的一種，是堿纖維素和環(huán)氧乙烷經(jīng)醚化反應(yīng)制備而成的白色或淡黃色無味無毒的纖維狀或粉末狀的非離子型水溶性纖維素醚［4］。該原料具有很多優(yōu)良的性質(zhì)，使其在工業(yè)方面得到廣泛的應(yīng)用：具有良好的水溶性，在冷水和熱水中均可溶解，對(duì)水和鹽水具有極強(qiáng)的親和力，穩(wěn)定性好，在酸性條件下也不會(huì)產(chǎn)生沉淀。羥乙基纖維素的主要用途是作為增黏劑來使用，能夠和水中的分散劑、高分子化合物發(fā)生作用使體系的黏度大幅度上升，其本身具有非離子型的特性，在水介質(zhì)中不會(huì)離子化，所以可以和許多水溶性的聚合物、表面活性劑、鹽共存，是含高濃度電解質(zhì)溶液的一種優(yōu)良的膠體增稠劑，并且對(duì)許多一價(jià)和二價(jià)的高濃度電解質(zhì)溶液有增稠作用。綜合以上內(nèi)容，羥乙基纖維素是一種十分優(yōu)良的增稠凝膠敷料基質(zhì)。

新型環(huán)保型高分子聚合物——聚六亞甲基單胍鹽酸鹽具有優(yōu)越的殺菌活性，屬于新一代的殺菌劑，其優(yōu)越性能主要體現(xiàn)在一下幾方面：（1）具有高效的殺菌能力，僅需少量添加就表現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌性能，平均殺滅率99.9%。（2）安全系數(shù)高，無毒副作用，對(duì)皮膚黏膜、眼睛無刺激，體外細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示細(xì)胞毒性小于1級(jí)。（3）作用時(shí)間持久，獨(dú)特的殺菌機(jī)理，不會(huì)引起細(xì)菌耐藥，長久有效。（4）環(huán)境友好型殺菌劑，無色無味、不揮發(fā)、不含重金屬和酚類物質(zhì)，對(duì)各類處理表面無腐蝕。憑借這些優(yōu)越的性能，該類殺菌劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、日用化學(xué)、紡織、造紙、水產(chǎn)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。在本產(chǎn)品中，胍鹽作為殺菌防腐劑顯示出卓越的性能。前期的微生物抑菌試驗(yàn)中，該產(chǎn)品對(duì)傷口中常見的諸如大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌都顯示出強(qiáng)大的殺滅效果，殺菌率達(dá)到了100%。

目前對(duì)于醫(yī)療器械材料的生物相容性評(píng)價(jià)方法包括動(dòng)物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)，根據(jù)材料的性質(zhì)和作用部位的不同，使用不同的評(píng)價(jià)方法。目前來說，被中國藥典和ISO收錄的方法有幾十種，但是中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886是國內(nèi)最權(quán)威的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)方法。根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途，對(duì)該傷口抑菌凝膠敷料進(jìn)行細(xì)胞毒和皮內(nèi)刺激等生物學(xué)評(píng)價(jià)，目的是為了預(yù)知和避免該材料應(yīng)用于人體后可能導(dǎo)致的不良反應(yīng)，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

［1］程娟，柯軍，顏林.殼聚糖創(chuàng)傷敷料的生物學(xué)評(píng)價(jià)［J］.中國醫(yī)療器械信息，2011，6（9）：40-42.

［2］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局GB16886.5-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［3］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局GB16886.10-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分，刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［4］趙明，邵自強(qiáng)，敖玲玲.羥乙基纖維素的性能、應(yīng)用與市場現(xiàn)狀［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2013，10（2）：70-78.

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