裙帶菜中巖藻黃質的提取純化工藝研究

周衛松,楊 艷,2,劉明社

(1.寧波天宏生物科技有限公司,浙江寧波 315800；2.中北大學,山西太原 030051)

裙帶菜中巖藻黃質的提取純化工藝研究

周衛松1,楊 艷1,2,劉明社1

(1.寧波天宏生物科技有限公司,浙江寧波 315800；2.中北大學,山西太原 030051)

本實驗以裙帶菜為原料提取巖藻黃質,通過單因素實驗分析,并正交實驗對提取條件進行工藝優化,最后采用硅膠柱層析做進一步的分離純化。實驗結果表明,經過預處理后的裙帶菜原料,加入12倍的提取溶液,95%丙酮浸提2.5h,提取3次,效果較好。提取后的浸提液經超濾除渣,硅膠柱層析,最終巖藻黃質含量可由原來的2.31%提高到24.2%,回收率達90.9%。

裙帶菜,巖藻黃質,高效液相色譜法,柱層析

裙帶菜屬于褐藻門翅藻科植物,營養價值高,是海洋主要經濟藻類之一,外觀形態如圖1。

圖1 裙帶菜形態Fig.1 Undaria pinnatifida botanical morphology

巖藻黃質(fucoxanthin)又名巖藻黃素、褐藻黃素,屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類脂溶性色素,具有良好的抗氧化作用,及抗腫瘤活性[1]、減肥、神經細胞保護等多方面的作用[2-3]。日本北海道大學研究人員通過小鼠實驗發現,巖藻黃質可以通過兩種方式消除脂肪堆積:激活被稱為UCP1蛋白,這種蛋白可以促進脂肪分解；刺激肝臟生成降低膽固醇水平的DHA[4]。巖藻黃質分子式:C42H58O6,結構式如圖2,不溶于水,溶于某些有機溶劑,如三氯甲烷、正已烷、石油醚等。在偏酸性溶液、弱光和低溫下比較穩定；在弱酸、弱堿條件下,發生顏色可逆變化；在強堿、強光或高溫條件下則被破壞[5]。

圖2 巖藻黃質(Fucoxanthin)結構式Fig.2 Chemical structure of fucoxanthin

目前國內巖藻黃質的生產銷售企業主要集中在北京、寧波及陜西三地。不同貨源產品質量良莠不齊,價格也相差非常大。根據最新的市場調研,目前國內市場能供應合格產品的公司不超過3家,國際市場也不超過8家,其中日本是走在最前列的。一般而言,合格產品10% UV巖藻黃質價格在USD 140/kg左右,1% HPLC、5% HPLC更分別高達USD 570/kg、USD 3000/kg,經濟價值相當可觀。

本實驗參考國內外相關文獻,結合巖藻黃質的化學特性,采用高效液相色譜探索建立準確高效簡便的巖藻黃質分析方法,并通過單因素及正交實驗分析,確定裙帶菜中巖藻黃質的最佳提取工藝,最后通過硅膠柱層析,達到進一步的純化目的,該工藝所得產品完全能符合當前國內外市場的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；島津SPD-20A紫外檢測器 日本島津公司；電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;SK1200H型超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司；SY-5000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型真空泵 上海亞榮生化儀器廠；SZ-97型自動純水蒸餾器 上海亞榮儀器廠；DHG-9070型數顯恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司,LGJ-18實驗型冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司。

巖藻黃巖藻黃質對照品 購于Sigma公司,純度大于98%。

裙帶菜 寧波天宏生物公司提供,產于浙江舟山群島。

甲醇為色譜純 SPECTAUM,乙腈為色譜純SPECTAUM；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。

1.2 裙帶菜巖藻黃質含量的高效液相色譜測定方法

巖藻黃質的檢測方法,目前主要有UV和HPLC兩種,UV方法原理是,將巖藻黃質樣品溶于復合有機溶劑中,充分溶解,完全過濾后,通過記錄比對450nm波長吸光度進行定量。由于通常巖藻黃質樣品自身含有大量的雜色素,而UV法前處理過程又過于簡單,沒有對雜色素的干擾采取任何相應的預處理措施,因此存在很大的局限性。本研究建立了高效快捷的HPLC檢測方法,后續提取純化部分也均以HPLC檢測數據為依據。

1.2.1 色譜條件 色譜柱Shim-pack VP-ODS C18(5μm,250mm×4.6mm)；流動相為乙腈-磷酸溶液(90∶10)；流速設定1.0mL·min-1;柱溫35℃；檢測波長取450nm。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取巖藻黃質標準品2.02mg,加甲醇制成100mL巖藻黃質標準溶液,0.45μm有機膜濾過,取濾過液,即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 稱取裙帶菜提取物適量,精密稱定,置50mL量瓶中,加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度,0.45μm有機膜濾過,取濾過液,即得。

1.2.4 測定方法 精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液各20μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標法計算樣品的含量。

1.2.5 巖藻黃質樣品含量計算公式:

式中:A樣-樣品峰面積；A標-標準品峰面積；C標-標準品濃度(g/mL)；N-稀釋倍數(mL)；M-樣品稱量(g)。

1.2.6 巖藻黃質的得率計算公式:

式中:C浸提液-浸提液濃度(g/mL)；V浸提液-浸提液體積(mL)；M藥材-提取藥材稱量(g)。

1.3 裙帶菜提取巖藻黃質單因素分析

實驗以巖藻黃質得率為響應值,選取影響裙帶菜巖藻黃質提取的溶劑比、提取溫度、時間、液料比等進行單因素實驗。

1.3.1 不同提取溶劑的影響 分別取60%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮十種溶劑為考察對象,稱取裙帶菜原料50g,料液比為1∶10,置于40℃恒溫水浴鍋中加熱2h,提取2次,浸提液過0.45μm微孔濾膜,HPLC測定,記錄相應的峰面積,計算巖藻黃質的得率。

1.3.2 溫度的影響 分別以20、30、40、50、60(熱回流)、70℃(熱回流)五個水平釜內溫度為考察對象,提取溶劑為丙酮,稱取裙帶菜原料50g,料液比1∶10,提取2h,共2次,浸提液過0.45μm微孔濾膜,HPLC測定,記錄相應的峰面積,計算巖藻黃質的得率,

1.3.3 料液比的影響 稱取裙帶菜原料50g,采用料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30六個水平為考察對象,丙酮為提取溶劑,50℃水浴,按照上述同樣方法進行單因素實驗,

1.3.4 提取時間的影響 以丙酮為提取溶劑,裙帶菜原料50g,料液比為1∶10,置于50℃恒溫水浴鍋中,提取2次,采用加熱1、2、3、4、5、8h六個水平為考察對象,按照上述同樣方法進行單因素實驗,

1.4 巖藻黃質提取工藝正交實驗

綜合分析單因素實驗中各因素影響,選取丙酮濃度、料液比、浸提時間和溫度做4因素3水平正交實驗,確定最佳提取工藝。

1.5 硅膠柱層析法純化巖藻黃質

1.5.1 TLC法定性分析 吸取一定量裙帶菜提取巖藻黃質溶液,點樣于硅膠G板右側,同時取巖藻黃質標準溶液,點樣于左側。石油醚-乙酸乙酯體系(80∶20,60∶40)和正己烷-乙醚體系(85∶15,80∶20)分別作展開劑。由于類胡蘿卜素本身具有非常明顯的顏色,可以無需噴顯色劑而直接收集不同的色帶進行光譜分析。

表1 加樣回收率實驗Table 1 Recovery experiments

1.5.2 硅膠柱的預處理 稱取一定量的200目硅膠放在燒杯里,在110℃下烘干4h,室溫靜置,冷卻,干法裝入層析柱(內徑×高度:30mm×600mm)中,壓緊。加入洗脫劑,高于液面2～3cm,平衡,靜置。

1.5.3 層析條件的優化 取巖藻黃質粗提樣品溶液(含量為0.5%),硅膠為固定相,正己烷-乙醚(85∶15)為洗脫劑。在室溫范圍內考察洗脫劑流速、進樣量等因素對硅膠層析分離效果的影響。

保持相關條件不變,改變層析時洗脫劑流速。洗脫劑流速在0.2BV·h-1時,含量和回收率都相對較低,分離時間長；流速1.8BV·h-1時,平均含量較低,洗脫劑消耗量大,色帶拖長。一般而言,流速如果偏低,軸向擴散影響會變大,層析效果就會較差；而流速如果偏大,兩相間深度難以達到分配平衡,也會使分離效果變差。

2 結果與分析

2.1 巖藻黃質HPLC標準工作曲線的建立

根據1.2巖藻黃質HPLC方法,分析對照品及裙帶菜提取物色譜圖見圖3和圖4,此色譜條件下巖藻黃質分離度良好。

圖3 巖藻黃質對照品HPLC圖譜Fig.3 Chromatogram of fucoxanthin standard sample

圖4 裙帶菜提取樣品的HPLC圖Fig.4 Chromatogram of Undaria pinnatifida extract sample

分別精密吸取巖藻黃質對照品溶液2.0、5.0、8.0、12.0、15.0、20.0μL進行測定,以峰面積為縱坐標,進樣量為橫坐標,繪制標準曲線,如圖5。

圖5 巖藻黃質HPLC標準曲線Fig.5 HPLC standard curve of fucoxanthin

得回歸方程為Y=1.1×107X+2038,R2=0.9996;表明巖藻黃質在0.040～0.400μg范圍內進樣量與峰面積呈良好線性關系。

2.2 巖藻黃質HPLC含量檢測的方法學考察

2.2.1 精密度實驗 取對照品溶液,按以上色譜條件于同一時間內重復進樣5次,測定峰面積,結果RSD為1.49%(n=5)。

2.2.2 穩定性實驗 取對照品溶液,按以上色譜條件每隔一定時間進樣1針,測定峰面積,結果在20h內供試品溶液峰面積RSD為1.98%。表明供試品溶液在20h內基本無變化,穩定性良好。

2.2.3 重現性實驗 取同一批號供試品樣品,按供試品制備方法制備5份供試液,測定巖藻黃質的峰面積,并計算巖藻黃質的含量和相對標準偏差。

2.2.4 加樣回收率實驗 精密稱取5份已知巖藻黃質含量的海帶提取物粉末各0.2g,分別精密加入巖藻黃質對照品溶液(0.042mg·mL-1)1.0mL,制備供試品溶液,進樣量10μL,測定巖藻黃質峰面積,計算巖藻黃質的含量并計算加樣回收率,結果見表1。

2.3 裙帶菜提取巖藻黃質單因素分析

2.3.1 不同提取溶劑對巖藻黃質得率的影響 如圖6。實驗結果表明,丙酮的提取效果最佳,提取2次,得率可達到0.072%,其次是95%乙醇,得率為0.036%。石油醚效果最差[7-8]。

圖6 不同提取溶劑Fig.6 Different extraction solvent

2.3.2 溫度對巖藻黃質得率的影響 如圖7。高溫有利于巖藻黃質的加速溶出。然而巖藻黃質屬于類胡蘿卜素,加熱條件下穩定性較差,易發生幾何異構。同時丙酮的沸點為56℃,浸提溫度在50℃時溶劑揮發嚴重,60℃以上則必須引入熱回流裝置。因此,綜合考慮浸提溫度宜控制在40～60℃范圍比較好。

圖7 不同提取溫度Fig.7 Different extraction temperature

2.3.3 料液比的影響 如圖8。實驗結果表明,隨著料液比的增大,巖藻黃質得率逐漸升高,至料液比超過1∶15后,巖藻黃質得率增加趨于平緩。考慮到實際生產中的溶劑消耗及其成本,1∶10左右的料液比可能更加適宜。

圖8 不同料液比Fig.8 Different ratio of material to liquid

2.3.4 提取時間對巖藻黃質得率的影響 如圖9。隨著提取時間的延長,巖藻黃質得率增大,但變化不明顯,超過2.0h后趨于平緩。

圖9 不同提取時間Fig.9 Different extraction time

2.4 巖藻黃質提取工藝正交實驗

綜合考慮各單因素影響,做4因素3水平正交實驗,見表2。

表2 正交實驗設計的各因素與水平Table 2 Factors and levels in orthogonal test

表3 正交實驗提取裙帶菜中巖藻黃質方案和結果Table 3 Orthogonal test method and result of fucoxanthin extraction from Undaria pinnatifida

由正交實驗分析,理論最優組合為A3B3C3D3,即丙酮濃度95%,浸提溫度55℃(引入熱回流裝置),料液比為1∶12,浸提時間為2.5h。在此條件下做驗證實驗,得率為0.088%,樣品進行HPLC色譜分析,即每100g裙帶菜可提取巖藻黃質粗品3.82g,含量為2.31%。

2.5 硅膠柱層析法純化巖藻黃質

2.5.1 TLC法定性分析 如圖10。4份薄層板中,左側均為巖藻黃質標準品色譜帶,右側為裙帶菜提取樣品色譜帶,可以非常清晰地觀察到提取樣品中巖藻黃質的位置。

圖10 不同展開劑的TLC層析圖譜Fig.10 TLC chromatogram from different developing solvent注：1.石油醚∶乙酸乙酯=80∶20；2.石油醚∶乙酸乙酯=60∶40； 3. 正己烷∶乙醚=85∶15,4. 正己烷∶乙醚=80∶20。

分析TLC圖譜,記靠近巖藻黃質斑最近的上側斑為A,靠近巖藻黃質斑最近的下側斑為B,分別計算Rf值,如表4。

TLC層析顯示石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙醚兩種洗脫劑的薄層層析比移值差別非常大。一般來講,在選擇洗脫劑時,既要保證溶質適當的溶解性,又要考慮其選擇性。因此,根據巖藻黃質斑的Rf值和組分斑點之間的相對距離,很容易篩選出正己烷∶乙醚(85∶15)為本次TLC柱層析實驗的最佳洗脫劑。

李丹彤等[6]也曾對裙帶菜中提取巖藻黃質進過TLC分析,他們分離出5條色譜帶,推測5條色譜帶分別為β-胡蘿卜素、脫鎂葉綠素a、葉綠素a、巖藻黃素和葉綠素c。本實驗由于條件限制,尚無法對此5條色帶帶進行一一驗證,但在TLC圖譜趨勢上與李丹彤實驗是吻合的。

表4 不同展開劑的TLC層析結果Table 4 TLC results from different developing solvent experiments

2.5.2 層析條件的優化 保持相關條件不變,改變層析時洗脫劑流速,結果如圖11。洗脫劑流速在0.2BV·h-1時,含量和回收率都相對較低,分離時間長；流速1.8BV·h-1時,平均含量較低,洗脫劑消耗量大,色帶拖長。一般而言,流速如果偏低,軸向擴散影響會變大,層析效果就會較差；而流速如果偏大,兩相間深度難以達到分配平衡,也會使分離效果變差。根據圖11,最終選擇洗脫劑流速為0.6BV·h-1。

圖11 不同流速的硅膠層析效果Fig.11 Effects of different folw rate on column purification注：進樣4.0 g,床層體積320mL。

保持相關條件不變,改變進樣量,結果如圖12。在進樣量較小(2.0g,6.25mg·mL-1)時,有較高的含量和較低的回收率，巖藻黃質和其他組分能得到較好的分離，但進樣量小時相對損失較大；隨著進樣量的加大，混合物各組分在層析柱中峰形部分重疊，巖藻黃質含量顯著下降，此時相對回收率先升后降。考慮到當前主流市場對巖藻黃質的含量要求并不高,只在5%,比較含量與回收率二因素,回收率顯得相對更為優先,同時較小的進樣量也不利于提高大生產時的工作效率,綜合考慮,單次進樣量8.0g,相當于25.0mg·mL-1柱體積為宜。

圖12 不同進樣量的硅膠層析效果Fig.12 Effect of different inject volume on column purification注：洗脫流速0.6BV·h-1,床層體積320mL。

確定優化層析條件,洗膠劑流速0.6BV·h-1,進樣量25.0mg·mL-1床層體積,在此條件下,測定硅膠柱層析過程的流出曲線,如圖13。

圖13 優化條件下的層析效果Fig.13 Column purification result in optimized condition注：洗脫流速0.6BV·h-1,進樣量25.0mg·mL-1柱體積。

收集含量較高的2.8～4.8BV洗脫組分,合并旋蒸,冷凍干燥,HPLC檢測巖藻黃質含量為24.2%,回收率90.9%。

2.5.3 層析柱的再生 層析完成后,柱中殘留較多雜質,柱體變為淡綠色。層析柱用乙醇洗脫2倍床層體積(640mL),再用洗脫劑3倍床層體積(960mL),重復進樣。按照選定的操作條件,重復進行6次層析分離,如圖14。

圖14 優化條件下6次重復層析效果比較Fig.14 6 different chromatography comparison in optimized condition

重復6次結果表明,每次層析得到巖藻黃質的含量和回收率基本相同,重復性較好,層析柱再生效果較好。乙醇極性較大,能有效地洗脫硅膠柱吸附的極性雜質成分,使層析柱恢復到初始狀態。乙醇再生,流動相平衡可以使層析柱重復利用多次。

進行驗證實驗,每100g裙帶菜可制備巖藻黃質0.33g,HPLC色譜分析,含量為24.2%,如圖15。

圖15 柱層析純化巖藻黃質樣品色譜圖Fig.15 HPLC chromatogram of purified fucoxanthin sample

3 結論

3.1 裙帶菜提取巖藻黃質的高效液相色譜分析,可選用色譜柱Shim-pack VP-ODS C18(5μm,25mm×4.6mm)；流動相:乙腈-磷酸溶液(90∶10)；流速:1.0mL·min-1；柱溫:35℃；檢測波長:450nm。色譜顯示巖藻黃質分離良好,進樣量在0.040～0.400μg范圍內與峰面積是良好的線性關系。本實驗表明該方法簡便、精確度高、分離效果好、專屬性強,可作為裙帶菜中巖藻黃質成分的定量檢測方法。

3.2 通過單因素實驗,確定以丙酮為巖藻黃質提取的最佳溶劑,復提3次最為經濟效率。同時選定正交實驗的合理設計因素應包括提取丙酮濃度、溫度、

料液比、提取時間等。

3.3 通過正交實驗,得出最佳浸提工藝為:提取溶劑為95%丙酮,料液比1∶12,溫度55℃(可引入熱回流裝置),提取時間為2.5h。進行回收驗證實驗,裙帶菜中巖藻黃質粗品的得率為0.088%,即每100g裙帶菜可提取巖藻黃質粗品3.82g,含量為2.31%。

3.4 硅膠柱層析法可達到進一步純化的目的,正己烷∶乙醚(85∶15)為洗脫溶劑,洗膠劑流速0.6BV·h-1,進樣量25.0mg·mL-1床層體積,巖藻黃質得率為0.080%,回收驗證實驗,每100g裙帶菜可制備巖藻黃質0.33g,HPLC含量為24.2%。經過硅膠柱層柱工藝,巖藻黃質損失率為9.1%,屬于可承受損失范圍。

[1]徐戎,張悅,王倩,曾繁典，等. 巖藻黃質(Fucoxanthin)抗肺癌作用及其機制研究[J]. 中國藥理學通報，2009,10(25).

[2]張文竹,劉紅兵,管華詩.裙帶菜的化學成分及其生物活性研究進展[J].海洋科學,2009,33(4):72-75.

[3]Fumiaki Beppu,Masashi Hosokawa,Yoshimi Niwano,etal. Effects of dietary fucoxanthin on cholesterol metabolism in diabetic/obese KK-Ay mice[J]. Lipids In Health and Disease,2012,11:112.

[4]Tsukui T,Baba N,Hosokawa M,etal.Enhancement of hepatic docosahexaenoic acid and arachidonic acid contents in C57BL/6J mice by dietary fucoxanthin[J]. Fishery Science,2009,75:261-263.

[5]肖策.海帶中巖藻黃質、巖藻甾醇、甘露醇和褐藻糖膠的綜合提取純化工藝研究[D]. 西安：西北大學. 2008:25-27.

[6]李丹彤,陳國棟,張玲麗,等.裙帶菜巖藻黃素的提取分離及對人肝癌細胞HepG2的抑制作用研究[J].遼寧師范大學學報：自然科學版,2012,(3):383-389.

[7]尹尚軍,徐濤,劉麗平,等.羊棲菜的提取工藝研究[J].食品工業科技，2011，4(32):272-275.

[8]李丹彤,陳國棟,張玲麗,等.裙帶菜巖藻黃素的提取分離及對人肝癌細胞 HepG2 的抑制作用研究[J].遼寧師范大學學報：自然科學版，2012，35(9):383-388.

Extraction and purification of fucoxanthin fromUndariaPinnatifida

ZHOU Wei-song1,YANG Yan1,2,LIU Ming-she1

(1.Ningbo Tianhong Biotech Co.,Ltd,Ningbo 315800,China；2.North University of China,Taiyuan 030051,China)

With single factor experiment and orthogonal test,this study aimed to extract fucoxanthin fromUndariapinnatifida,silica gel column chromatography as further purification. The experimental results showed that,12 times 95% acetone,2.5h,55℃,extracting for 3 times,were more efficient and economic. The purity of fucoxanthin could be improved from 2.31% to more than 24.2% after silica gel column purification.

Undariapinnatifida;fucoxanthin;HPLC;column chromatography

2014-04-29

周衛松(1983-)，男，工程碩士，研究方向：天然藥物提取分離純化。

TS255.1

B

1002-0306(2015)03-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.046