紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李 波,包怡紅,高 鋒,王振宇

(1.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省農業(yè)科學院科研處,黑龍江哈爾濱 150086;3. 黑龍江省農業(yè)科學院,黑龍江哈爾濱 150086)

紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李 波1,2,包怡紅1,*,高 鋒3,王振宇1

(1.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省農業(yè)科學院科研處,黑龍江哈爾濱 150086;3. 黑龍江省農業(yè)科學院,黑龍江哈爾濱 150086)

本文研究了紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk雙倒數法分析了其動力學性質。結果表明,紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用略弱于陽性對照阿卡波糖,二者的半數抑制濃度分別為713.94μg/mL和623.73μg/mL;對α-淀粉酶的抑制作用明顯不及陽性對照阿卡波糖,二者的半數抑制濃度分別為1902.91μg/mL和865.96μg/mL。動力學分析結果顯示紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用均為非競爭性抑制類型。

紅松松球鱗片,多酚,α-淀粉酶,α-葡萄糖苷酶,抑制

餐后高血糖的發(fā)生與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性密切相關,這兩種酶的活性越強,水解淀粉和低聚糖的量也就越多,進而導致葡萄糖在小腸黏膜上吸收加快[1]。因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性是控制餐后血糖升高的一個重要途徑,也就是說,通過對這兩種酶的抑制作用能夠有效降低餐后高血糖的發(fā)生[2]。一直以來,植物多酚有益于人類健康的生物活性備受研究學者關注。目前已研究證實,植物多酚不僅能夠減少氧化應激作用,而且能夠通過抑制碳水化合物水解酶的作用來預防高血糖[3-4]。

我國紅松資源豐富,但對其多酚類物質的研究還很少。本項研究前期實驗表明,紅松松球鱗片含有豐富的多酚類物質,而且該類多酚具有很好的抗氧化性。本實驗通過研究紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk雙倒數法研究其動力學性質,揭示紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松球鱗片 收集于2011年9月份,地點在黑龍江省伊春林區(qū),自然晾干后粉碎過60目篩,其乙醇提取液經AB-8樹脂柱層析純化、Sephadex LH-20凝膠柱層析純化后,減壓濃縮,冷凍干燥得純化的紅松松球鱗片多酚(PP,Purified Polyphenol)粉末；豬胰α-淀粉酶(PPA)、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) 購自Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;ELx800NB 酶標儀 美國BioTek公司;PHS-3C型數字酸度計 上海精密科學儀器有限公司;FA2004型電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-淀粉酶活性抑制實驗 α-淀粉酶活性測定參照張永軍等[5]的方法,略加修改。取20μL α-淀粉酶溶液,分別加入20μL不同濃度的多酚溶液,混合均勻后置于37℃水浴中預熱,然后加入40μL預熱到37℃的1%淀粉溶液,在該溫度下反應3min后,立即加入80μL DNS顯色溶液,沸水浴8min,冷至室溫后,加800μL蒸餾水稀釋,用酶標儀于540nm波長處測吸光值A2。另取20μL磷酸鹽緩沖溶液代替多酚溶液,測得無抑制劑時酶反應體系的吸光值A1,計算出抑制率,并進行多元非線性擬合,利用回歸方程求出半數抑制濃度。抑制率計算公式為:

抑制率(%)=[(A1-A2)/A1]×100

式(1)

式中：A1和A2分別代表無抑制劑和有抑制劑時的酶反應體系的吸光值。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗 α-葡萄糖苷酶活性測定參照Xu Hai-Wei等[6]的方法,并略加修改。分別取不同濃度的多酚溶液100μL,加入1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50μL,37℃水浴10min后,加入已經預熱到37℃、5mmol/L的底物PNPG溶液50μL,37℃水浴10min,立即加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL,用酶標儀于405nm波長下測定吸光值A2,另取100μL磷酸鹽緩沖溶液代替多酚溶液,測得無抑制劑時酶反應體系的吸光值A1,按照式(1)計算出抑制率,并進行多元非線性擬合,利用回歸方程求出半數抑制濃度。

1.2.3 動力學分析 固定底物濃度,改變酶濃度,分別測定添加和不添加紅松松球鱗片多酚時反應體系的吸光值,并計算酶反應速率,然后根據酶反應速率與酶濃度之間的變化關系作圖,判斷其抑制類型是否可逆。

固定酶濃度,改變底物濃度,分別測定添加和不添加紅松松球鱗片多酚時反應體系的吸光值,并計算酶反應速率,按照Lineweaver-Burk作圖法,以酶反應速率的倒數對底物濃度的倒數作圖,求得米氏方程。根據方程確定米氏常數Km和最大反應速率Vmax,通過比較有無紅松松球鱗片多酚存在時的Km和Vmax的變化來判斷其可逆性抑制類型。

1.2.4 數據分析處理 所有實驗均重復3次,取平均值。采用Excel軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶抑制作用分析

2.1.1 半數抑制濃度的確定 圖1所示的是紅松松球鱗片多酚和陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用結果。由圖可知,隨著二者濃度的增加,其對α-淀粉酶的抑制作用也都在增強,呈現(xiàn)了良好的量效關系。但是在整個測試濃度范圍內,陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用要顯著優(yōu)于紅松松球鱗片多酚,通過比較二者的EC50值,我們也可以確認這一點,紅松松球鱗片多酚的EC50值為1902.91μg/mL,而阿卡波糖的EC50值僅為865.96μg/mL。

圖1 不同濃度多酚對α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of polyphenol on α-amylase

2.1.2 抑制類型的確定 紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶的抑制動力學曲線如圖2所示。當反應體系中有可逆性抑制劑存在時,得到的直線通過原點,但斜率小于無抑制劑的直線斜率,當體系中存在不可逆抑制劑時,得到的直線不通過原點[7-8]。因此由圖2可推斷出,紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶的抑制類型為可逆性抑制。

圖2 多酚對α-淀粉酶的抑制動力學曲線Fig.2 Kinetics curves of inhibition of α-amylase

2.1.3 可逆性抑制類型的確定 可逆性抑制一般分為四種類型,即為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合性抑制。在確定抑制機理時,根據抑制作用的雙倒數圖,分別計算出無抑制劑和有抑制時反應體系的米氏常數Km和最大反應速率Vmax,通過比較二者的變化,即可推斷出可逆性抑制類型[9]。

圖3所示的是固定α-淀粉酶濃度,在不添加和添加紅松松球鱗片多酚(2mg/mL)條件下,改變底物淀粉的濃度(0.5%～2%),得到的Lineweaver-Burk曲線。由圖可以看出,兩條直線相交于橫軸。通過兩條直線方程計算得出,有抑制存在時,米氏常數Km值17.42mg/mL,最大反應速度Vmax為0.5049mg/mL·min;無抑制劑存在時,米氏常數Km值16.49mg/mL,最大反應速度Vmax為1.045mg/mL·min。由此可知,和無抑制劑時相比,當紅松松球鱗片多酚存在時,α-淀粉酶催化淀粉的酶促反應的最大反應速Vmax降低了,而米氏常數Km基本保持不變,因此推測紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶屬非競爭性抑制類型。

圖3 多酚對α-淀粉酶的抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of polyphenol on α-amylase

2.2 紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

2.2.1 半數抑制濃度的確定 通過測定不同濃度的紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率,并以阿卡波糖作為陽性對照,來確定多酚的抑制作用,其結果如圖4所示。由圖4可以看出,隨著紅松松球鱗片多酚濃度的增加,其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也在增強,呈現(xiàn)了良好的量效關系。濃度在1000～2000μg/mL范圍內,紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用同阿卡波糖相近,這也說明了紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制效果。但通過比較二者的EC50值,我們發(fā)現(xiàn)紅松松球鱗片多酚(EC50,713.94μg/mL)對α-葡萄糖苷酶的抑制能力略弱于陽性對照阿卡波糖(EC50,623.73μg/mL)。

圖4 不同濃度多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of polyphenol on α-glucosidase

2.2.2 抑制類型的確定 通過測定不同α-葡萄糖苷酶酶濃度在添加和不添加抑制劑(多酚濃度為750μg/mL)時的酶反應速率,得到多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線,如圖5所示。由圖5可知,紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆性抑制。

圖5 多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線Fig.5 Kinetics curves of inhibition of α-glucosidase

2.2.3 可逆性抑制類型的確定 固定α-葡萄糖苷酶濃度,在不添加和添加紅松松球鱗片多酚(750μg/mL)條件下,改變底物PNPG的濃度(2～5mmol/L),測定反應體系的反應速率,得到α-葡萄糖苷酶在有無抑制劑存在時的Lineweaver-Burk曲線。根據圖6中的兩條直線方程可以計算出,有抑制存在時,米氏常數Km值5.867mmol/L,最大反應速度Vmax為0.138mmol/Lmin;無抑制劑存在時,米氏常數Km值5.929mmol/L,最大反應速度Vmax為0.241mmol/Lmin。由此可知,和無抑制劑時相比,當紅松松球鱗片多酚存在時,α-葡萄糖苷酶催化PNPG的酶促反應的最大反應速Vmax降低了,而米氏常數Km基本保持不變,因此推測紅松松球鱗片多酚對α-葡萄糖苷酶屬非競爭性抑制類型。

圖6 多酚對α-葡萄糖苷酶的 抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plot for inhibition of polyphenol on α-glucosidase

3 結論與討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑,如已廣泛應用于臨床的阿卡波糖、伏格列波糖等對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都有很強的抑制作用,使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢,從而減緩腸道內葡萄糖的吸收,降低餐后高血糖。但是,這些抑制劑同時也具有一些副作用,像腹脹、腹痛、腹瀉、胃腸痙攣性疼痛、頑固性便秘等。先前的一些研究表明,這些副作用是抑制劑對α-淀粉酶的過度抑制導致了結腸部位未被吸收的碳水化合物經細菌發(fā)酵產生的[10]。因此,更有效的抑制劑應當是在有效控制餐后高血糖的同時,能減少這些副作用,即這種抑制劑對α-葡萄糖苷酶有很強抑制作用,而對α-淀粉酶有較溫和的抑制作用[11-12]。

體外實驗研究表明,紅松松球鱗片多酚可有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性,其作用效果雖然略弱于阿卡波糖,但是其對α-淀粉酶的抑制作用比較溫和,說明該多酚組分不僅能對淀粉酶促水解直至生成葡萄糖的整個過程產生抑制作用,從而可有效延緩單糖的釋放和吸收,抑制餐后高血糖;而且還能避免或減緩對α-淀粉酶的過度抑制導致的一些副作用。抑制作用的動力學分析表明,紅松松球鱗片多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制反應類型均為可逆的非競爭性抑制。

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Inhibitory effect of polyphenols from Korean pine cone lamella on α-amylase and α-glucosidase

LI Bo1,2,BAO Yi-hong1,*,GAO Feng3,WANG Zhen-yu1

(1.College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.Department of Scientific Research Management,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;3. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Inhibition kinetics of α-amylase and α-glucosidase by polyphenols from Korean pine cone lamella was studied. The results suggested that inhibitory activity of polyphenols(EC50,713.94μg/mL)on α-glucosidase was slightly lower than that of the positive control acarbose(EC50,623.73μg/mL)and inhibitory effect of polyphenols(EC50,1902.91μg/mL)on α-amylase was significantly lower than that of acarbose(EC50,865.96μg/mL). A Lineweaver-Burk plot indicated that the inhibition of polyphenols from Korean pine cone lamella on α-amylase and α-glucosidase were both uncompetitive.

Korean pine cone lamella;polyphenols;α-amylase;α-glucosidase;inhibition

2014-03-20

李波(1980-)，男，在讀博士，副研究員，主要從事植物活性成分的分離與開發(fā)。

*通訊作者:包怡紅(1970-)，女，博士，教授，主要從事功能性食品開發(fā)研究。

國家自然科學基金(31170510)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0063-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.004