牛精蛋白的純化及抑菌效果研究

劉亞娜,李儒仁,安邁瑞,余群力,*,于春起,韓廣星

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.河北三河五豐食品有限公司,河北三河 065200;3.山東綠潤食品有限公司,山東臨沂 276000)

牛精蛋白的純化及抑菌效果研究

劉亞娜1,李儒仁1,安邁瑞1,余群力1,*,于春起2,韓廣星3

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.河北三河五豐食品有限公司,河北三河 065200;3.山東綠潤食品有限公司,山東臨沂 276000)

以牛睪丸為原料研究牛精蛋白純化工藝及抑菌性能,以提高牛精蛋白抑菌能力和牛副產物利用率。牛睪丸經5.48%硫酸溶液超聲波輔助提取,95%冷乙醇沉淀,丙酮、乙醚洗滌后得牛精蛋白粗品。采用陽離子交換層析(SP-Sepharose Fast Flow)和凝膠過濾層析(Sephacryl S-100)對牛精蛋白粗品進行純化,純化后的牛精蛋白得率為3.92%。經SDS-PAGE分析，牛精蛋白分子量為19ku。以新鮮牛肉、醬牛肉、新鮮豆干和醬豆干為抑菌對象,發現純化牛精蛋白溶液處理的菌落總數極顯著小于粗提牛精蛋白溶液處理的菌落總數(p<0.01),且分別降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%。純化后的牛精蛋白具有很強的抑菌能力,是一種良好的天然食品防腐劑。

牛睪丸,精蛋白,純化,抑菌

精蛋白(Protamine)是一種廣泛存在于各類雄性動物成熟精巢組織中的多聚陽離子肽,氨基酸組成中2/3以上是精氨酸[1]。精蛋白在食品、醫藥、保健品等領域均有廣泛應用,尤其在食品加工業中,由于其抑菌譜廣、熱穩定性好、安全無副作用等特點,在天然食品防腐劑使用方面具有廣闊前景。

目前,市場上主要的食品防腐劑有化學防腐劑和天然防腐劑兩大類,其中天然食品防腐劑由于其安全無毒、抑菌性強及作用范圍廣而受到廣泛青睞。精蛋白作為一種新型天然食品防腐劑而成為研究熱點,相關研究主要集中在從魚類精巢組織中提取魚精蛋白,并對其營養成分和功能進行分析。如Tom A. Gill等人[1]以鯡魚為原料,采用硫酸或鹽酸優化鯡魚精蛋白提取工藝,結果表明,用鹽酸和硫酸提取鯡魚精蛋白的得率分別為1.1%和1.5%。劉紅玉等人[2]以大馬哈魚為原料,對其精蛋白提取工藝進行篩選,最終分離得到具有較強抑菌活性的大馬哈魚精蛋白。從哺乳動物精巢中分離精蛋白的研究僅在雙駝峰中有報道,實驗提取的雙峰駝精蛋白活性較高,其大小在15～18ku,且對金色葡萄球菌有明顯抑菌效果[3]。然而,有關牛精蛋白的研究報道甚少。我國肉牛資源豐富,牛睪丸作為其副產物之一,來源廣泛,價格低廉,但利用率低[5]。因此,提高牛精蛋白的純度并研究其抑菌性能,對天然食品防腐劑的開發和牛副產物資源的利用具有重要意義。

本研究以牛睪丸為原料提取牛精蛋白,并對牛精蛋白進行抑菌實驗,為天然食品防腐劑開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛睪丸 河北三河五豐食品有限公司、山東綠潤食品有限公司,用水清洗后除去附著在睪丸上的脂肪、結締組織、血塊和污物等,將處理過的樣品于-80℃下凍藏待用;新鮮牛肉、新鮮豆干 北京華聯超市。

SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100 General Electric Company;牛血清白蛋白 Sigma;丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺、DTT、α-巰基乙醇,均為國產電泳級;其它試劑均為國產分析純。

JY92-ⅡDN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器公司;SP-756P型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;PPS-2蛋白純化系統 上海金達生化儀器有限公司。

1.2 牛精蛋白粗品提取工藝

本工藝參考文獻[7]。

1.2.1 主要工藝流程 牛睪丸→組織搗碎→離心→收集沉淀→提取→離心→過濾上清液→冰浴沉淀→離心→收集沉淀→洗滌→真空干燥→牛精蛋白粗品

1.2.2 操作方法 稱取100g解凍的牛睪丸,置于高速組織搗碎機中,加入200mL 0.14mol/L NaCl溶液勻漿1min,冰浴攪拌20min后靜置10min。離心(4000r/min,0℃,10min),棄去上清液。在沉淀中加入5.48%硫酸溶液,超聲波(188.54W)輔助提取10min,離心(4000r/min,0℃,10min),將上清液過濾,所得沉淀再重復提取1次,將濾液合并。加入95%冷乙醇冰浴沉淀30min,離心(8000r/min,0℃,10min),所得沉淀用丙酮洗滌2次,乙醚洗滌1次后真空干燥,得牛精蛋白粗品。

1.3 牛精蛋白純化工藝

1.3.1 SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析 根據文獻[8-10]，填料活化裝柱后,依次使用蒸餾水和緩沖液A(pH9.0 25mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉)平衡。設置緩沖液A為副通道,B(1.0mol/L NaCl溶液)為主通道,流速為1.0mL/min。將牛精蛋白粗品溶解于緩沖液A,采用進樣泵自動進樣后梯度洗脫。根據紫外檢測值所顯示的峰型收集樣品,每管收集3.0mL。測定每管收集樣品的蛋白含量,并將全部有抑菌活性的樣液混合濃縮以備凝膠過濾層析使用。

1.3.2 Sephacryl S-100凝膠過濾層析 根據文獻[11-13]，填料活化裝柱后,分別使用蒸餾水和緩沖液C(pH5.4 25mmol/L乙酸-乙酸鈉)平衡。設置流速為0.2mL/min。采用手動方式進樣,待樣品完全進入填料后用緩沖液C洗脫。根據紫外檢測值所顯示的峰型開始收集樣品,每管收集3.0mL。測定每管收集樣品的蛋白含量,并將全部有抑菌活性的樣液混合濃縮以備后期實驗使用。

1.4 牛精蛋白含量及蛋白得率的測定

牛精蛋白含量采用考馬斯亮藍蛋白質含量測定法[14]。

離子交換層析或凝膠過濾層析后,分別將全部有抑菌活性的樣液混合濃縮,真空干燥。

式中,m1為真空干燥后的蛋白質量;m2為牛睪丸樣品的質量。

1.5 SDS-PAGE

將得到的純化牛精蛋白進行不連續SDS-PAGE,濃縮膠濃度為5%,分離膠為12%,電泳緩沖液為pH 8.3的Tris-Gly(三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸),蛋白染色為考馬斯亮藍R250溶液,脫色至條帶清晰可見后拍照。以標準蛋白marker為對照,確定牛精蛋白分子量。

1.6 牛精蛋白的抑菌實驗

1.6.1 供試樣品 供試樣品Ⅰ:新鮮牛肉。

供試樣品Ⅱ:醬牛肉。將牛肉切塊后,加入佐料及適量水,文火醬制3h,制成醬牛肉。

供試樣品Ⅲ:新鮮豆干。

供試樣品Ⅳ:醬豆干。在新鮮豆干中加入佐料及適量水,文火醬制3h,制成醬豆干。

1.6.2 樣品處理 每種樣品各稱取三份,每份20g。配制濃度5%的粗提牛精蛋白溶液(X)和純化牛精蛋白溶液(Y)各200mL,無菌水作對照。將樣品分別在三組溶液中浸泡1min后瀝干,于室溫下保藏24h。加入100mL無菌水,勻漿后加倍遞增稀釋。分別吸取1.0mL 10-4和10-5級稀釋液置于已滅菌的培養皿中,倒瓊脂平板,于37℃培養24h后,計算菌落總數[9]。實驗重復三次。

1.7 數據處理

使用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 牛精蛋白含量測定的標準曲線

灰白色細砂巖，棕紅色、棕黃色泥巖不等厚互層，砂巖鈣質膠結，泥巖呈塊狀。中細砂巖主要為灰白色，較致密，主要礦物成分為石英、長石。結構密實，孔隙接觸式膠結，含有較多灰巖顆粒，有灰黑色灰巖顆粒。泥巖為棕紅色、棕褐色、棕黃色泥巖，呈塊狀，堅硬斷面，吸水，含有白色石膏顆粒。細砂巖：主要為灰白色，較致密；成分為石英、長石；結構密實，孔隙接觸式膠結，有部分鈣質膠結，有白色石膏顆粒，有灰黑色灰巖顆粒。該地層據測井解釋成果反映，共有31層砂巖，砂巖總厚度為43.4 m，砂厚比為14.42%，單層厚度最大為2.6 m，最薄為0.6 m。

以牛血清白蛋白為標品做標準曲線,如圖1所示:

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of the BSA

由圖1可知,標準曲線方程為:y=5.8171x+0.0065,式中,y為吸光度值;x為牛血清白蛋白濃度,單位mg/mL,R2=0.9984。

2.2 牛精蛋白的分離純化

2.2.1 SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析 由圖2知,樣品經SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離純化后先后得到三個蛋白峰。經抑菌活性實驗驗證,其中第一個洗脫峰為雜蛋白峰,此時混合洗脫液中不含NaCl;第二個洗脫峰為活性峰,即具有抑菌活性的牛精蛋白位于第23～31管,NaCl濃度為0.15～0.25mol/L;第三個洗脫峰也為雜蛋白峰,NaCl濃度為0.25～0.35mol/L。此結果說明牛精蛋白粗提液經SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析后得到初步分離,且3個組分于含有不同NaCl濃度的洗脫液中被洗脫出來,這是由于離子強度梯度對混合洗脫液中不同組分與SP-Sepharose Fast Flow的電荷吸附能力存在差異所造成。純化所得牛精蛋白得率為4.21%。將全部有抑菌活性的幾管溶液收集并濃縮,準備下一步純化。

表1 菌落總數計數結果(cfu/mL)Table 1 Total number of colony on studied samples(cfu/mL)

圖2 SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of SP-Sepharose Fast Flow

注:同行不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01),同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。2.2.2 Sephacryl S-100凝膠過濾層析

由圖3知,樣品經Sephacryl S-100凝膠過濾層析分離純化后先后得到三個蛋白峰。經抑菌活性檢測,活性峰處于第二個和第三個洗脫峰中間,即具有抑菌活性的牛精蛋白溶液位于第28～43管。牛精蛋白峰出現較晚,可能是由于牛精蛋白在被純化的樣品中屬于分子量較小的蛋白。經過兩步純化后牛精蛋白得率為3.92%,與SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析相比,得率降低0.29%。

圖3 Sephacryl S-100凝膠過濾層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of Sephacryl S-100

2.3 SDS-PAGE分析

圖4 牛精蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of bovine protamine注:M-標準蛋白;1-粗品;2-純化后的牛精蛋白。

由SDS-PAGE圖譜可知,純化后的牛精蛋白圖譜呈現單一的蛋白條帶,表明分離純化得到的牛精蛋白純度較高,其分子量約為19ku。由已有報道知,鰱魚精蛋白純品的分子量約為13ku[6];鯉魚精蛋白分子量約為3ku[9];雙峰駝精蛋白的分子量在15～18ku間[3]。相較于魚精蛋白的分子量,牛精蛋白的分子量較大,但與雙峰駝精蛋白的分子量相近,這可能是原料本身存在差異所造成。SDS-PAGE圖譜結果還表明,純化時所選填料具有良好的色譜性能,將其應用于牛精蛋白的分離純化,取得了較好的純化效果。

2.4 抑菌實驗

將牛精蛋白溶液應用于牛肉和豆干的防腐,觀察對樣品中腐敗菌的抑制效果,其菌落總數計數結果見表1。

由表1知,室溫條件下,分別經粗提牛精蛋白溶液(X)、純化牛精蛋白溶液(Y)、蒸餾水處理的新鮮牛肉、醬牛肉、新鮮豆干及醬豆干,菌落總數差異極顯著(p<0.01),具體表現為對照組極顯著大于X處理組,X處理組極顯著大于Y處理組。樣品經Y處理后的菌落總數,與X處理組相比,新鮮牛肉、醬牛肉、新鮮豆干、醬豆干分別降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%。由此可知,純化牛精蛋白比粗提牛精蛋白對牛肉和豆干樣品中腐敗菌的抑制作用更強,也說明牛精蛋白抑菌性能強,作為天然食品防腐劑使用的潛力巨大。

經過牛精蛋白溶液處理,牛肉和豆干樣品中的菌落總數存在顯著性差異(p<0.05),這可能是樣品本身存在差異所造成。本抑菌實驗所選的樣品(牛肉和豆干)均為日常食用品,營養豐富,具有一定的代表性。實驗結果證實了牛精蛋白較好的抑菌性能,與已有報道中精蛋白抗菌特性結果相吻合[3,9]。

3 結論

3.1 經離子交換層析(SP-Sepharose Fast Flow)和凝膠過濾層析(Sephacryl S-100)分離純化,牛精蛋白得率分別為4.21%和3.92%。

3.2 純化后的牛精蛋白SDS-PAGE圖譜呈現單一的蛋白條帶,分子量約為19ku。

3.3 純化牛精蛋白溶液處理的新鮮牛肉、醬牛肉、新鮮豆干及醬豆干,菌落總數均極顯著小于粗提牛精蛋白溶液處理組(p<0.01),且分別降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%,純化后的牛精蛋白溶液抑菌能力大幅提高,抑菌性能強。

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Research of purification and antibacterial effect of bovine protamine

LIU Ya-na1,LI Ru-ren1,AN Mai-rui1,YU Qun-li1,*,YU Chun-qi2,HAN Guang-xing3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Hebei Sanhe Wellful Food Company,Sanhe 065200,China;3.Shandong Lorain Food Company,Linyi 276000,China)

The purification process and antimicrobial activity of bovine protamine extracted from bovine testis were studied,for purpose of improving purity and utilization of bovine protamine. Crude bovine protamine was gained by ultrasonic-assisted extracting with 5.48% sulfuric acid solution,precipitating with 95% cold ethanol,washing with acetone,ether. Bovine protamine was purified by SP-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 gel filtration chromatography,and the yield was 3.92%. The molecular weight was 19ku analyzed by SDS-PAGE. The result of antibacterial test indicated the total number of colonies of fresh beef,sauced beef,fresh bean curd and sauced bean curd dealt with bovine protamine purified were greatly significant less than them dealt with crude bovine protamine(p<0.01),and respectively decreased 86.44%,85.77%,83.39%,89.82%. Bovine protamine purified had strong antimicrobial activity,which showed bovine protamine was a well natural food preservative.

bovine testes;protamine;purification;antimicrobial

2014-03-25

劉亞娜(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:畜產品加工。

*通訊作者:余群力(1962-)，男，博士，教授，主要從事畜產品貯藏加工研究。

國家現代農業產業技術體系資助(CARS-38)；公益性行業(農業)科研專項(201203009)。

TS251.9

A

1002-0306(2015)01-0066-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.005