火棘果不同極性部位提取物體外抗氧化研究

翁文江,高 雪,*

(1.重慶工商大學催化與功能有機分子重慶市重點實驗室,重慶 400067;2.重慶工商大學天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室,重慶 400067；3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067)

火棘果不同極性部位提取物體外抗氧化研究

翁文江1,2,3,高 雪1,2,3,*

(1.重慶工商大學催化與功能有機分子重慶市重點實驗室,重慶 400067;2.重慶工商大學天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室,重慶 400067；3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067)

目的:系統地評價火棘果粗分體系抗氧化活性,同時探究抗氧化能力與總多酚含量之間的關系。方法:用75%乙醇冷浸提取火棘果,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水分為四個不同極性部位,然后測定了各部位萃取物對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力,并且測定了總還原力、FRAP值和總多酚含量,同時考察總酚含量與抗氧化活性的關系。結果:火棘果提取物的不同極性部位均有抗氧化活性,其中水、乙酸乙酯和正丁醇部位提取物表現出較好的抗氧化活性,石油醚部位的抗氧化活性最弱;各部位提取物的抗氧化活性與總多酚含量呈現較好的相關關系。其中,水部位提取物對DPPH和ABTS+自由基清除率最高,IC50值分別為(0.76±0.03)mg/mL和(1.71±0.10)mg/mL;乙酸乙酯部位FRAP值最大,為(382.20±4.72)μmolFe2+/g干樣;正丁醇部位總酚含量最高,為(2763±3.91)mgGAE/100g干樣。

火棘果,抗氧化活性,總多酚含量

火棘(Pyracanthafortuneana)為薔薇科蘋果亞科(Maloideae)火棘屬(Pyracantha)多年生常綠灌木[1]。火棘的藥用曾記載于《滇南本草》和《本草綱目》,近年來的研究表明火棘果實具有潛在的食用和藥用開發價值。據報道火棘果具有無毒、清除自由基、增強免疫力、降低血脂和促進代謝等作用[2],有關火棘果清除自由基的研究多集中于總提物、火棘多酚和火棘多糖等成分[2-4]。為了系統地評價火棘果總提物不同極性部位的抗氧化活性,同時探究抗氧化能力與其總多酚含量之間的關系,本文檢測了火棘果不同極性部位提取物清除DPPH·、ABTS+·的活性,總還原能力、FRAP法抗氧化能力以及總酚含量,獲取了火棘果不同極性部位提取物體外抗氧化基礎數據,分析了四種抗氧化檢測方法的相關關系以及抗氧化活性與總多酚含量的相關關系,可望為火棘果開發植物性天然無毒抗氧化劑和功能性保健食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火棘果 采自重慶城口縣;1,1-二苯基苦基苯阱(DPPH) 上海晶純試劑有限公司;抗壞血酸(分析純) 阿拉丁公司;ABTS[2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽] 上海山浦化工有限公司;TPTZ(2,4,6-三吡啶基均三嗪) 東京化成工業株式會社;福林酚 天津光復精細化工研究所;無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵等 國產分析純。

Re-2000型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;明澈-D24UV實驗室超純水機 Millipore公司;Acculab電子天平 德國賽多利科學儀器有限公司;Infinite M200型酶標儀 Tecan公司;Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 Thermo Fisher公司;Gilson P型微量移液器 四川吉爾森儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 火棘果不同溶劑提取工藝 將新鮮摘取的干凈野生火棘果放入60℃烘箱中烘干,粉碎,用75%乙醇冷浸提取3次,每次7d。浸出液經過濾、減壓濃縮、干燥得到火棘果總提物。將總提取物溶于溫水中,依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取2～3次,合并萃取液,最后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的萃取物。將各組萃取物減壓濃縮后,真空冷凍干燥至恒重,密封置于冰箱冷藏備用。

1.2.2 各相萃取物清除DPPH自由基活力的檢測 采用Blois等[5]的方法并加以改進。用無水乙醇將DPPH配制成1mmol/L的溶液。在1.5mL tuber管中分別準確加入200μL樣品待測溶液和200μL DPPH溶液,混和均勻后,然后暗處室溫下放置30min,最后在波長517nm處測定吸光值,平行測定3次,用抗壞血酸(VC)為陽性對照。按下列式子計算各待測樣品對DPPH自由基的清除率:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai為200μL DPPH試劑與200μL樣品溶液的混合液吸光度;Aj為200μL樣品溶液與200μL無水乙醇混合液的吸光度;Ac為200μL無水乙醇與200μL DPPH溶液的混合液吸光度。

1.2.3 各相萃取物清除ABTS自由基活力的檢測 采用Carrasco-Castilla等[6]的方法并加以調整。取38.4mg ABTS溶解于10mL水中形成7mmol/L的溶液,然后加入6.6mg過硫酸鉀固體,溶液顏色瞬間變成藍綠色,旋渦均勻后形成的混合溶液中過硫酸鉀的最終濃度為2.45mmol/L,迅速將上述混合溶液置于室溫黑暗條件下12～16h。測試樣品之前,將上述溶液用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到在734nm處的吸光度為0.70±0.002,得到待測ABTS+·溶液。將990μL ABTS+·液中加入10μL的樣品溶液,旋渦均勻之后孵育5min檢測吸光值。用抗壞血酸(VC)為陽性對照,ABTS+自由基清除百分比計算:

清除率(%)=[1-(A-B)/C]×100

其中,A:990μLABTS+10μL樣品/對照品混合液的吸光度;B:990μL磷酸緩沖液+10μL樣品/對照品混合液的吸光度;C:990μL ABTS+10μL去離子水混合液的吸光度。

1.2.4 各萃取部位總還原力的測定 采用Liu S和馬合木提·買買提明[7-8]的方法并稍加調整。取火棘提取物溶液100μL與250μL 0.2mol/L pH6.6的磷酸納緩沖液和250μL 1%的K3Fe(CN)6混合均勻,混合溶液在50℃水浴中孵育30min。將10%的三氯乙酸250μL加入混合溶液后旋渦均勻,室溫下3000r/min離心20min。最后,取250μL上清液、250μL蒸餾水和0.1%的FeCl3溶液50μL混合均勻,在700nm處檢測吸光度。用抗壞血酸(VC)為陽性對照。

1.2.5 各萃取部位FRAP值檢測 參考Benzie等[9]的方法并加以改進。將300mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH3.6)、20mmol/L FeCl3溶液、40mmol/L HCl 配制的10mmol/L TPTZ溶液按照體積比10∶1∶1混合均勻,配制成FRAP試劑,備用。取100μL樣品或對照物和1mL 預熱至37℃的FRAP混合、旋渦均勻,5min后593nm處檢測吸光值,去離子水作為參照液。根據以上相同步驟,用FeSO4標準溶液做出標準曲線。通過吸光值求得標準曲線上相應FeSO4的濃度(μmolFe2+/L),定義FRAP值為樣品FRAP值等值于每克干樣品中Fe2+微摩爾數(μmolFe2+/g干樣品)。

1.2.6 總多酚含量(TPC)測定 根據福林酚比色法原理,采用Kim等[10]的方法并加以改進。取50μL一定濃度的樣品液與25μL福林酚試劑混合均勻,孵育3min,然后加入2%(w/v)的Na2CO3溶液1mL,旋渦均勻,常溫暗室放置60min后于756nm讀吸光值。根據以上相同步驟,用沒食子酸標準溶液做出測總酚的標準曲線,樣品總酚含量等值于每100g干樣品中五倍子酸的毫克數(mgGAE/100g干樣品)。

1.3 數據處理與相關性分析

計算結果以均值±標準差(x±s)表示,繪圖采用Origin7.1軟件,相關性分析由SPSSv19.0軟件分析。抗氧化活性的相關性分析以樣品濃度為1.25mg/mL的數據帶入。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基能力

DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,具有單一電子,在波長為517nm下具有最大光吸收,有自由基清除劑存在時,DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺[11]。根據表1可知,火棘果提取物清除DPPH自由基的能力:在較低濃度范圍下,水相和乙酸乙酯部位萃取物清除DPPH自由基的能力相差不大,清除效果均較好,正丁醇部位次之,效果最差的是石油醚部位提取物。

表1 不同溶劑提取物體外抗氧化實驗清除自由基IC50值、FRAP值和總酚含量Table 1 The results of antioxidant activity in vitro(IC50,FRAP)and TPC of different solvent extracts

注:同一行標記字母不同,表示顯著差異,p<0.05。

水部位提取物和乙酸乙酯部位提取物清除自由基的能力強,IC50均小于1mg/mL,分別為(0.76±0.03)mg/mL和(0.80±0.01)mg/mL。當濃度達到2.5mg/mL時,水部位提取物對DPPH自由基清除率達到93.45%,乙酸乙酯部位提取物對DPPH自由基清除率高達94.79%。可能的原因是清除DPPH自由基活性成分主要被富集在水部位和乙酸乙酯部位。

圖1 不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH· scavenging rate of different solvent extracts

2.2 清除ABTS自由基能力

ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+,在抗氧化物存在時ABTS+的產物會被抑制[12],已廣泛應用于天然藥物、海洋生物、果蔬類等的抗氧化能力的評價。火棘果各部位提取物表現出的ABTS+自由基清除活力對濃度呈正相關。其中,水部位提取物清除ABTS+自由基的IC50值為(1.71±0.10)mg/mL,正丁醇部位和乙酸乙酯部位提取物分別為(2.11±0.24)mg/mL和(3.43±0.12)mg/mL,石油醚部位最弱,IC50值大于5mg/mL,效果都要差于陽性對照VC。當濃度達到5mg/mL時,乙酸乙酯部位提取物對ABTS+自由基清除率為78.50%,水部位提取物清除率則為86.34%。由表1和圖2可以得出,水相部位提取物對ABTS+自由基清除能力最強,石油醚部位最弱。出現這種結果的原因可能是火棘果中清除ABTS+自由基的活性成分極性大小較大,主要富集于水部位和正丁醇部位。李偉等[4]研究發現由于物質結構的差異,同一種多酚類物質對不同自由基清除率有差異。因而推測引起火棘果不同極性部位對兩種自由基清除作用的差異可能與火棘果活性成分結構的不同以及自由基的結構性質有關。

圖2 不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除作用Fig.2 ABTS+· scavenging rate of different solvent extracts

2.3 總還原力測定結果

在還原能力測定實驗中,樣品中的抗氧化劑的存在將導致鐵氰化鉀中Fe3+得到一個電子被還原成Fe2+,Fe2+進一步生成在700nm處有最大吸光值的普魯士藍,因此測定700nm處吸光值可以反應抗氧化劑還原能力的大小[13]。一般地,樣品在一定濃度范圍內,還原力強弱與抗氧化性溶液濃度呈正相關性。由圖3可知,VC在較低濃度就表現出非常好的總還原能力,火棘果各部位總還原能力最強的是水部位萃取物,乙酸乙酯和正丁醇部位部位萃取物次之,石油醚部位萃取物的總還原能力最弱,均弱于陽性對照VC。樣品濃度低于0.625mg/mL時,還原力相差不大;樣品濃度高于1.25mg/mL時,總還原力值開始出現差異,但乙酸乙酯部位和水部位依然差異不明顯。

圖3 不同溶劑提取物的總還原能力Fig.3 Reduction abilities of different solvent extracts

2.4 FRAP值測定結果

Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質還原為二價鐵形式,呈現出藍色,并于593nm處具有最大光吸收,根據吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強弱,FRAP值越大,抗氧化活性越強。通過線性擬合,FeSO4標準曲線方程式為:Y=1.1408X-0.004,R2=0.9999,p<0.0001。各相提取物中抗氧化成分將Fe3+-TPTZ還原成Fe2+-TPTZ復合物,吸光度明顯隨提取物濃度的增加而增加。由表1可以得知,乙酸乙酯部位和水部位提取物的FRAP值均較大,鐵還原能力強,石油醚部位提取物的FRAP值相對較低,鐵還原能力弱。研究發現中藥材山楂和山茱萸提取物的FRAP值分別為為332.00±3.23、311.10±17.77[14],效果均要弱于火棘果不同極性部位提取物。說明火棘果有較好的鐵離子還原能力。

2.5 總多酚含量測定結果

植物多酚是植物體內最普遍存在的次生代謝物質,是植物次生代謝物質唯一的分子水平上的防御物質,植物多酚的研究對于揭示植物的化學防御和微生物、植食動物的協同進化機制具有重要意義[15]。沒食子酸標準曲線方程:Y=0.0182+2.9582X,R2=0.9995,p<0.0001。火棘果提取物的總酚含量見表1。從表1中正丁醇部位、乙酸乙酯部位、水部位萃取物總酚含量均較多,石油醚部位含量最少。其中正丁醇部位總酚含量最大((2763±3.91)mgGAE/100g干樣品),是總酚含量最小的石油醚部位((1987±3.28)mgGAE/100g干樣品)的1.4倍。研究結果表明,火棘果中總酚類物質的極性較大,大部分富集于正丁醇部位和乙酸乙酯部位。

2.6 抗氧化活性方法間相關性分析

運用SPSS軟件進行分析,進行了四種抗氧化檢測方法的相關性分析,結果見表2,DPPH·清除法、FRAP法和總還原力的相關性好,相關系數均在0.855以上,其中,FRAP法與DPPH·清除法和總還原力法的相關性最好,分別為0.935、0.941。總體看來,火棘果提取物對DPPH·、ABTS+·、PRAP和總還原力體系抗氧化活性基本一致,但又略有差異。出現差異的原因可能是由于粗提物的活性成分比較復雜,且不同抗氧化檢測方法的機理不同[11-13]所致。

表2 四種檢測方法相關性分析Table 2 Correlation analysis of four methods and TPC

注:*表示在0.05水平上顯著相關,**表示在0.01水平上顯著相關。表3同。

2.7 總多酚含量與抗氧化活性相關性分析

根據表3,DPPH·清除法、ABTS+·清除法、FRAP法和總還原力法測定的抗氧化活性與總多酚含量之間均存在相關關系,其中,FRAP法、總還原力法測定的抗氧化活性與總多酚含量的相關系數分別為0.847和0.944(p<0.01),而DPPH法、ABTS法測定結果與總多酚含量的相關性相對較弱(p<0.05),相關系數均小于0.75。綜上所述,總多酚含量與四種抗氧化檢測模型存在較好的相關關系,說明各部位提取物中的抗氧化活性物質主要是多酚類物質。多酚類物質含有的酚羥基具有提供質子氫的能力,能夠淬滅和還原自由基,終止自由基鏈式反應,從而起到抗氧化的作用。研究發現藍莓葉提取物總酚含量與抗氧化活性相關性及顯著[16],火棘果提取物的研究結果與之相似。

表3 火棘果抗氧化活性與總多酚含量的相關關系Table 3 Correlation analysis of the antioxidant activity and TPC

3 結論

由于不同抗氧化檢測方法的反應機理不同,為獲得可靠的結論,本實驗運用DPPH·清除法、ABTS+·清除法、FRAP法和總還原力法對火棘果不同極性溶劑提取物的抗氧化能力進行了系統的評價。火棘果四種不同極性部位提取物表現出對DPPH·、ABTS+·、FRAP和總還原力良好的抗氧化活性,且相關性基本一致,但略有差異。火棘果水部位對DPPH·、ABTS+·的清除活性最強,IC50值分別為0.76mg/mL和1.71mg/mL;乙酸乙酯部位FRAP值最高,但與水部位相差不大。

大量的實驗研究表明,酚類化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物質基礎[7-8]。本實驗對總多酚與抗氧化活性的相關性分析結果表明,火棘果不同極性部位提取物的抗氧化能力與總多酚含量存在較好的相關關系(p<0.05),也提示火棘果中除多酚類化合物外,還存在其他具有抗氧化活性的物質。

本研究綜合評價了火棘果總提物不同極性部位的體外抗氧化活性,同時探究了抗氧化能力與總多酚含量之間的關系,可望為火棘果的進一步開發和利用提供科學的實驗數據和理論依據,為深入挖掘火棘果在食品、醫學等領域的應用提供參考價值。

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Study on antioxidant activityinvitroabout different solvent extracts of fruits ofPyracanthafortuneana

WENG Wen-jiang1,2,3,GAO Xue1,2,3,*

(1. Chongqing Key Lab of Catalysis & Functional Organic Molecules,Chongqing Teachnology and Business University，Chongqing 400067,China;2. Chongqing Key Laboratory of Natural Medicine Research,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China;3.School of Environment and Biological Engineering,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China)

Objective:To evaluatethe antioxidant activity of fruits ofPyracanthafortuneanacomprehensively,and explore the relationship between the antioxidant activity and total polyphenol content. Methods:Extracting fruits ofPyracanthafortuneanawith 75% ethanol,petroleum ether,ethyl acetate,n-butanol and water extracts were obtained. All extracts were evaluated by DPPH free radical and ABTS+free radical scavenging activity,the total reducing power,the fluorescence recovery after photobleaching experiment(FRAP)and the total polyphenol content. Conclusions:All extracts of fruits ofPyracanthafortuneanaexhibited antioxidant activities. The water,n-butanol and ethyl acetate extracts both exhibited preferable antioxidant activity,the petroleum ether extract had the weakest antioxidant activity. Antioxidant activities of both extracts were generally positively related with the total polyphenol content. The water extract showed the highest radical scavenging rate on DPPH and ABTS+,the IC50were (0.76±0.03)mg/mL and (1.71±0.10)mg/mL. The ethyl acetate extract showed the highest value of FRAP with(382.20±4.72)μmolFe2+/g. The highest content of total phenolics was from n-butanol extract with (2763±3.91)mg GAE/100g.

fruits ofPyracanthafortuneana;antioxidant activities;total polyphenol content

2014-03-05

翁文江(1990-),男，在讀碩士研究生，研究方向：環境生物質資源化研究。

*通訊作者:高雪(1980-)，女，博士，副研究員，研究方向：天然產物化學的研究。

重慶市科技創新團隊項目(KJTD201020)；國家自然科學基金資助(21402017)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0077-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.008