藏茜草不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

景臨林，馬慧萍，范小飛，2，楊貝貝，彭曉霞，賈正平，*

(1.蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科，甘肅蘭州 730050；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫學院，甘肅蘭州 730000)

藏茜草不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

景臨林1，馬慧萍1，范小飛1，2，楊貝貝3，彭曉霞3，賈正平1，*

(1.蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科，甘肅蘭州 730050；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫學院，甘肅蘭州 730000)

采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、羥自由基清除法、超氧陰離子清除法、還原力測定法和螯合力測定法六種抗氧化模型對藏茜草95%乙醇提取物以及石油醚相,乙酸乙酯相,正丁醇相和水相等4個不同極性部位的抗氧化活性進行評價,同時分析抗氧化活性與總酚和總黃酮含量的關系。研究結果表明,除水提部位外,藏茜草其它4個極性部位提取物均表現出一定的抗氧化活性,其抗氧化活性與多酚和總黃酮含量呈顯著相關。其中,乙酸乙酯部位總黃酮和總多酚含量最高,抗氧化活性也最強,其總黃酮和總多酚含量分別為(232.03±1.74)mg蘆丁當量/g提取物和(173.53±1.75)mg 沒食子酸當量/g 提取物,其清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和ABTS自由基的EC50分別為0.06±0.01、0.17±0.01、(0.24±0.02)mg/mL和(1.75±0.23)μg/mL,對金屬離子螯合力的EC50為(0.11±0.01)mg/mL。藏茜草的乙酸乙酯極性部位具有顯著的抗氧化活性,是天然抗氧化活性化合物的良好來源。

藏茜草,抗氧化活性,總黃酮,總多酚

活性氧(ROS)是細胞有氧代謝過程中的產物,其在低濃度時參與機體的免疫過程,抵御外界刺激對機體的損害。但是過量ROS會誘導脂質過氧化,破壞核酸、蛋白質、DNA等生物大分子,導致細胞衰老或死亡[1]。研究表明:心腦血管疾病、神經退行性疾病、癌癥和衰老的發生發展都有ROS代謝異常有關[2]。合理補充抗氧化劑能夠保護機體免受ROS誘導的氧化應激損傷,延緩人體衰老,增強人體免疫能力,對多種疾病具有預防作用[3]。人工合成抗氧化劑,如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等,雖有一定抗氧化作用,但是可能會引起肝臟損傷,甚至誘導癌癥的發生[4]。因此,從食用及藥用植物中尋找廣譜、低毒、安全、有效的天然抗氧化劑已成為抗氧化劑發展的必然趨勢。

藏茜草是一種傳統藏藥,藏藥名:佐,以茜草科植物西藏茜草(RubiatibeticaHook. F)的干燥根及根莖入藥,具有清熱涼血等功效,主治血病、擴散傷熱、肺腎熱邪和大小腸熱[5]。藏茜草生長于海拔3600m處河灘礫石上,主要產自西藏阿里札達,通過千百萬年的進化選擇,適應了高原缺氧、寒冷干燥的氣候環境,體內含有的特殊產物可能具有很好的抗氧化活性,但是關于藏茜草抗氧化研究未見報道。本文采用DPPH、ABTS、羥自由基、超氧陰離子、還原力和螯合力六種體外抗氧化模型對藏茜草95%乙醇提取物以及石油醚相,乙酸乙酯相,正丁醇相和水相等4個極性部位的抗氧化活性進行研究,并測定其總多酚和總黃酮含量,進行相關性分析,為藏茜草資源開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏茜草 購自青海西寧三江寶商貿有限公司,并經蘭州大學藥學院生藥研究所楊永健教授鑒定為西藏茜草(RubiatibeticaHook. F)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、菲啰嗪(Ferrozine) sigma公司;還原型輔酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗壞血酸(VC)、鉬酸銨、硫代巴比妥酸(TBA) 阿拉丁試劑公司;蘆丁標準品、水楊酸標準品 中國食品藥品檢定研究院;鎢酸鈉、鉬酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸(TCA)、硫酸、鹽酸等均為市售分析純試劑。

DJ-04B小型中藥粉碎機 上海鼎廣機械設備有限公司;Spectramax i3多功能酶標儀 Molecular Devices公司;RE52CS型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;AE204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;SK3300L超聲清洗器 上海精密儀器儀表有限公司;UV2800SPC紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 藏茜草的提取按照文獻方法[6]進行,具體步驟為:干藥材用粉碎機粉碎,準確稱量100g藥材粉末,用500mL 95%乙醇浸泡12h,超聲提取30min,再回流提取2h,重復提取兩次,趁熱過濾,合并濾液,減壓濃縮得到淺棕色浸膏,為藏茜草95%醇提部位(15.61g)。提取物加5倍量的蒸餾水超聲30min后得到懸浮液,將其移置500mL分液漏斗中,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次,合并各自萃取液并保留水相,減壓除去溶劑后,真空干燥至恒重,得到不同溶劑萃取物,分別為石油醚部位(0.77g),乙酸乙酯部位(4.18g),正丁醇部位(3.50g)和水提部位(3.16g)。

1.2.2 抗氧化活性的測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除實驗 不同質量濃度(0.1～0.4mg/mL)的樣品和VC溶液125μL,分別加入125μL 0.1mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中,暗處室溫反應30min,以95%乙醇溶劑做空白對照,測量其在波長517nm 處的吸光度(Ai)。測定125μL DPPH 95%乙醇溶液與125μL 95%乙醇混合后在波長517nm 處的吸光度(A0);測定125μL 95%乙醇溶液與125μL樣品溶液在波長517nm處的吸光度(Aj)[7]。按式(1)計算其清除率,并計算其EC50。

清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100

式(1)

1.2.2.2 ABTS+·清除實驗 將等體積的7mmol/L ABTS 溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀混合使之反應并置于暗處12～16h,制備ABTS+·。用95%乙醇將ABTS+·溶液稀釋至其在波長734nm處吸光度為0.70±0.02。將100μL不同質量濃度(0. 025～0.4mg/mL)樣品和VC溶液加入3.9mL ABTS+·溶液中,室溫放置10min,測量其在波長734nm處的吸光度(Ai)。測定3.9mL ABTS+·溶液與100μL 95%乙醇混合后在波長734nm處的吸光度(A0);測定3.9mL 95%乙醇溶液與100μL樣品溶液在波長734nm處的吸光度(Aj)[8]。按式(1)計算其清除率,并計算其EC50。

1.2.2.3 超氧陰離子自由基清除實驗 不同質量濃度(0.2～1.6mg/mL)的樣品和VC溶液100μL,依次加入50μL 500μmol/L的NADH(溶解于0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH7.4)、50μL 200μmol/L的NBT和50μL 20μmol/L的PMS。置于25℃條件下反應8min,測量其在波長560nm 處的吸光度(Ai)。測定50μL NADH、50μL NBT和50μL PMS與100μL 95%乙醇混合后在波長560nm處的吸光度(A0);測定50μL NADH、50μL NBT和50μL 水與100μL樣品溶液在波長560nm處的吸光度(Aj)[9]。按式(1)計算其清除率,并計算其EC50。

1.2.2.4 羥自由基清除實驗 不同質量濃度(0.0625～1.0mg/mL)樣品和VC溶液500μL,依次加入28mmol/L脫氧核糖(溶于pH7.0的0.2mmol PBS 磷酸緩沖液)中50μL、1mmol/L的EDTA 50μL、1mmol/L的氯化亞鐵50μL和1mmol/L的H2O250μL,最后加入1mmol/L的抗壞血酸50μL啟動反應,37℃水浴孵育1h,加入10%三氯乙酸250μL終止反應,再加入0.5% TBA(溶于25mmol/L的NaOH溶液),105℃孵育0.5h,于532nm處測得吸光度(Ai),用500μL蒸餾水代替樣品溶液,測得吸光度(A0),用PBS代替脫氧核糖測得吸光度(Aj)[10]。按式(1)計算其清除率,并計算其EC50。

1.2.2.5 金屬離子螯合能力實驗 不同質量濃度(0.03125～0.5mg/mL)的樣品和EDTA溶液1mL,加入1mmol/L 的FeCl2·4H2O 50μL和5mmol/L Ferrozine 40μL,振蕩混勻。37℃孵育10min后,測定波長562nm處吸光度(Ai)。用水代替Ferrozine時測得吸光度(Aj),用95%乙醇代替樣品溶液時測得吸光度(A0)[11]。按式(1)計算其螯合率,并計算其EC50。

1.2.2.6 還原力測定實驗 不同質量濃度(0.1～0.5mg/mL)的樣品和VC溶液1.0mL,加入0.2moL/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)2.5mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL,50℃水浴孵育20min,快速冷卻,然后加入2.5mL 10%(w/v)三氯乙酸溶液,混合溶液3000r/min離心10min,精密吸取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液,在700nm處測吸光度A,吸光度值越大,還原力越強[12]。

1.2.3 含量測定

1.2.3.1 總黃酮含量測定 將0.5mL不同質量濃度的蘆丁標準品溶液(0～140μg/mL)置于2mL離心管中,加入5% NaNO2溶液50μL,搖勻,靜置 6min,加入10% Al(NO3)3溶液50μL,搖勻,靜置 6min,最后加入的1mol/L NaOH溶液250μL,搖勻,靜置15min,510nm波長處測吸光值,重復三次,取平均值。以蘆丁的質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。根據蘆丁標準曲線,按照相同方法求得各樣品中總黃酮含量[13]。

1.2.3.2 總酚含量的測定 將0.1mL不同質量濃度的沒食子酸標準品溶液(0～140μg/mL)置于4mL離心管中,加入1mL Folin-Ciocalteu試劑,振蕩5min后加入1mL 7% Na2CO3溶液充分混勻,室溫放置5h,760nm波長處測吸光值,重復三次,取平均值。以沒食子酸的質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。根據沒食子酸標準曲線按照相同方法求得各樣品中總酚含量[14]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 藏茜草不同極性部位對DPPH自由基的清除作用

圖1 藏茜草不同極性部位對DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging activity of different extract from R tibetica Hook. F

由圖1和表1可知,不同極性部位對DPPH自由基清除能力存在顯著差異,且在0.0125～0.2mg/mL終濃度范圍內呈明顯的量效關系。其中,乙酸乙酯部位的EC50為(0.06±0.01)mg/mL,隨顯著高于VC的EC50(0.013±0.002)mg/mL,但仍然表現出較高的自由基清除能力。正丁醇部位和95%醇提部位清除DPPH自由基能力相當,且活性較小,而水提部位對DPPH自由基幾乎沒有清除作用。

2.2 藏茜草不同極性部位對ABTS自由基的清除作用

由圖2和表1可知,除水提部位外,其它四個極性部位對ABTS+·均表現出一定的清除能力,且有明顯的量效關系。其中乙酸乙酯部位對ABTS+·清除能力最強,在質量終濃度10μg/mL時,清除率可達97.89%。不同極性部位清除ABTS+·自由基的能力順序為:乙酸乙酯部位>石油醚部位>95%醇提部位>正丁醇部位>水提部位。

圖2 藏茜草不同極性部位對ABTS自由基的清除率Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different extract from R tibetica Hook. F

圖3 藏茜草不同極性部位對·的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging activity of different extract from R tibetica Hook. F

表1 藏茜草不同極性部位對5種抗氧化評價方法的清除率EC50Table 1 The EC50of different extracts from R tibetica Hook. F by five antioxidant assays

2.4 藏茜草不同極性部位對羥自由基(OH·)清除作用

Fenton反應產生的羥自由基能將脫氧核糖降解為丙二醛,丙二醛與硫代巴比妥酸反應生成的紅色物質在532nm處有最大吸收,通過檢測吸光度值的變化可以反映羥自由基清除能力。從圖4和表1可知,在測試濃度范圍內,藏茜草不同極性部位清除羥基自由基的能力隨樣品濃度增大而逐漸增強,但均弱于VC。各極性部位對羥基自由基的清除能力的順序為正丁醇部位>95%醇提部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位>水提部位

圖4 藏茜草不同極性部位對OH·的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of different extract from R tibetica Hook. F

2.5 藏茜草不同極性部位對金屬的螯合能力測定

測定亞鐵離子螯合能力的大小是評價氧化劑抗氧化性能常用的方法之一,金屬離子螯合后可降低其在自由基氧化過程中催化作用,減少自由基生成。螯合能力越強被評價的抗氧化劑潛在的抗氧化性就愈強。Ferrozine能夠與Fe2+形成紫紅色的螯合物,當其他有競爭力的螯合劑存在時,紫紅色會變淺。通過螯合物顏色的變化,可以評價物質對Fe2+的螯合能力。圖5和表1所示的結果表明,EDTA具有極強的金屬螯合活性;除水提部位外,藏茜草不同極性部位均具有很強的螯合作用,在低濃度(0.125mg/mL)時,各極性部位對Fe2+的螯合率順序為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位>95%醇提部位,但是在高濃度(0.5mg/mL)時,各極性部位對Fe2+的螯合率差別不大,分別為95%醇提部位(89.36%)、正丁醇部位(86.12%)、乙酸乙酯部位(81.13%)、石油醚部位(75.58%)。

圖5 藏茜草不同極性部位對金屬離子的螯合率Fig.5 Chelating ability of different extract from R tibetica Hook. F

2.6 藏茜草不同極性部位的還原力測定

物質的還原能力與其抗氧化活性之間有一定的相關性,鐵氰化鉀被抗氧化物質還原成亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀與三價鐵離子反應,生成的普魯士藍在700nm有最大吸收峰。吸光度越大,還原能力越強。從圖6可以看出:乙酸乙酯部位還原能力最強,石油醚部位、正丁醇部位和95%醇提部位的還原能力相當,表現出弱的還原力,而水提部位幾乎沒有還原能力。

圖6 藏茜草不同極性部位的還原力Fig.6 Reduce power of different extract from R tibetica Hook. F

2.7 藏茜草不同極性部位總黃酮含量測定

樣品中的總黃酮含量由蘆丁標準曲線:Y=6.9399X-0.0023(R2=0.9998)換算得來,各極性部位的總黃酮含量如表2所示:乙酸乙酯部位中總黃酮含量最高,為(232.03±1.74)mg蘆丁當量/g提取物,水提部位的含量最低,僅(1.87±0.11)mg蘆丁當量/g提取物;石油醚部位中總黃酮含量較多,為(84.59±1.26)mg蘆丁當量/g提取物,然后依次是正丁醇部位和95%醇提部位,分別是(63.96±0.77)和(48.78±1.40)mg蘆丁當量/g提取物。

2.8 藏茜草不同極性部位總多酚含量測定

樣品中的多酚含量由沒食子酸標準曲線:Y=5.8343X+0.0086(R2=0.9988)換算得來,各提取部位的多酚含量如表2所示:乙酸乙酯部位中總多酚含量最高,為(173.53±1.75)mg 沒食子酸當量/g提取物,然后依次是石油醚部位、正丁醇部位和95%醇提部位,分別是42.29±0.89、39.89±1.03、(36.29±0.72)mg沒食子酸當量/g提取物。水提部位多酚含量最低,僅為(3.25±1.04)mg沒食子酸當量/g提取物。

表2 藏茜草不同極性部位中總黃酮和總酚含量測定Table 2 Total flavonoid and phenolic content in different extracts from R tibetica Hook. F

2.9 抗氧化活性間相關性分析

表3 藏茜草抗氧化活性測定方法間相關系數(r)Table 3 Correlation coefficient(r) of five models of antioxidant activity

注:*表示在0.05水平上顯著相關,**表示在0.01水平上顯著相關;表4同。

2.10 多酚、黃酮含量與抗氧化活性相關性分析

研究表明:植物的抗氧化活性與其多酚和黃酮含量有密切相關[15],通過對藏茜草不同極性部位的總多酚和總黃酮含量進行測定和相關性分析,通過統計學分析藏茜草產生抗氧化活性的物質基礎,為進一步提取分離有效成分提供依據。

表4 藏茜草抗氧化活性與其總黃酮含量 和多酚含量的相關系數(r)Table 4 Correlations between the antioxidant activity and total phenolics and flavonoids content of R tibetica Hook F

3 結論

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Study on the antioxidant activity of different extracts fromRubiatibeticaHook. F.

JING Lin-lin1,MA Hui-ping1,FAN Xiao-fei1,2,YANG Bei-bei3,PENG Xiao-xia3,JIA Zheng-ping1,*

(1. Department of Pharmacy,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command of CPLA,Lanzhou 730050,China;2.Department of Medicinal Chemistry,Lanzhou University,Lanzhou 730000, China;3.Gansu college of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

The present study was carried out to evaluate the antioxidant capacity of the 95% ethanol crude extracts and their four solvent fractions(petroleum ether,ethyl acetate,normal butyl alcohol and aqueous)ofRubiatibeticaHook. F. The extracts of theRubiatibeticaHook. F. were evaluated for their total phenols,total flavonoids and antioxidant activity(DPPH radical,ABTS radical,hydroxyl radical,superoxide scavenging effect,reducing power and ferrous ions chelating activities). The relationship between the antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids was analysed. The results showed that all the fraction except water fraction had great antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids had a highly significant correlation with the activity. The ethyl acetate fraction was the most effective fraction with the highest content of total phenolics and total flavonoids and the content of them were(232.03±1.74)mg rutin equivalent/g extract and(173.53±1.75)gallic acid equivalent mg/g extract,respectively. The EC50values of ethyl acetate fraction based on DPPH,superoxide,hydroxyl radical and ABTS was 0.06±0.01,0.17±0.01,(0.24±0.02)mg/mL and(1.75±0.23)μg/mL. The EC50of ethyl acetate fraction on ferrous ions chelating activities was(0.11±0.01)mg/mL. Ethyl acetate fraction ofRubiatibeticaHook. F,a strong ability to act as antioxidant,may be considered as a natural source of active compounds.

RubiatibeticaHook. F;antioxidant activity;total flavonoids;total phenolics

2014-03-18

景臨林(1982-)，男，博士，研究方向：天然產物化學。

國家自然科學基金項目(81202458)；全軍醫藥科研“十二五”面上項目(CLZ12JA04)；中國博士后科學基金(2012M521926)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)01-0091-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.011