蘋果幼果中酚類物質抗氧化活性研究

陳瑋琦,郭玉蓉,張 娟,竇 姣,張曉瑞

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

蘋果幼果中酚類物質抗氧化活性研究

陳瑋琦,郭玉蓉*,張 娟,竇 姣,張曉瑞

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

蘋果幼果,多酚,抗氧化性

蘋果為我國產量最大的水果,占全球蘋果總產量6000萬t的40%,資源十分豐富。而我國目前的蘋果加工企業主要集中于蘋果濃縮汁等半成品的生產,產品結構單一,附加值低,嚴重影響著我國蘋果加工業的發展[1-2]。因此,充分利用蘋果生長周期過程中的各類有效資源,研究開發新的蘋果深加工產品已成為當務之急。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果幼果采摘自陜西禮泉。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2,2-Diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine,TPTZ)、福林酚 美國Sigma公司;沒食子酸 中國藥品生物制品檢定所;鄰二氮菲、鄰苯三酚 天津市光復精細化工研究所。所用試劑均為分析純。

7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Ar2140型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;KQ-250DB 型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 新鮮蘋果幼果,實驗前進行打漿處理,現制現用。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制 采用Folin-ciocalteu法[10]。精確稱取沒食子酸標準品0.110±0.001g,溶解定容至100mL容量瓶中,備用。吸取上述沒食子酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分別置于50mL容量瓶中,定容至刻度,即得濃度分別為10、20、30、40、50μg/mL的沒食子酸工作液。準確吸取1mL上述不同濃度工作液,加入5mL 10%福林酚,充分反應,靜置8min后加入4mL 7.5%Na2CO3溶液,混勻后于常溫下置于暗處反應2h,以蒸餾水調零,在765nm處測定吸光度。以質量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制沒食子酸標準曲線,其線性回歸方程為:y=0.011x+0.1068，R2=0.9996。

1.2.3 蘋果幼果多酚的提取及含量測定 準確稱取切碎勻漿后的新鮮蘋果幼果10.00g,在55℃條件下用100mL 70%乙醇超聲波輔助提取30min,過濾,重復提取3次,合并濾液,減壓濃縮除去乙醇,并用X-5大孔樹脂進行純化,除去乙醇后真空冷凍干燥得多酚樣品。然后按照繪制標準曲線的方法操作,重復測定吸光度3次,帶入回歸方程,計算蘋果幼果中多酚含量。

1.2.4 蘋果幼果多酚抗氧化活性的測定

1.2.4.1 FRAP法[11-13]測定蘋果幼果多酚總還原力 物質的還原能力與其總抗氧化能力呈顯著正相關。蘋果幼果多酚總還原力的測定采用Benzie[14]等建立的Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP)法測定其總抗氧化活性大小。Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質還原為二價鐵形式,使溶液呈現明顯藍色,于593nm處有最大吸收光,根據吸光度的大小評價樣品總抗氧化活性/還原能力的強弱。配制TPTZ工作液參考文獻[14]。FeSO4標準曲線繪制:準確量取0.5mL不同濃度的FeSO4溶液,分別加入1.5mL蒸餾水和3mL TPTZ工作液,充分混勻后于37℃反應0.5h,后于593nm處測定吸光度。以FeSO4質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。蘋果幼果多酚總抗氧化活性測定:按照繪制FeSO4標準曲線的方法操作,測定吸光度值大小,重復測定3次,根據FeSO4標準曲線和吸光度值,計算FeSO4當量濃度(mg/L)。FRAP值越大,即FeSO4當量濃度越大,蘋果幼果多酚抗氧化活性越強。

1.2.4.2 蘋果幼果多酚對DPPH·清除作用 DPPH·在有機溶劑中是一種穩定的自由基,其甲醇溶液呈紫色,在517nm處有強吸收光。實驗采用分光光度法測定加入幼果多酚提取液后樣品吸光度值的變化,以此表示其對DPPH·清除能力,結果以對DPPH·清除率表示,清除率越大,則抗氧化性越強[15-16]。操作如下:向裝有0.5mL不同濃度梯度的樣品甲醇溶液中加入4.5mL DPPH甲醇溶液(0.025mg/mL),搖勻,暗處室溫放置30min,于517nm處測定吸光度的變化。每個樣品重復3次。清除率按下式計算:

SA(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

式中:SA表示對DPPH·的清除率,%;Ai表示幼果多酚和DPPH甲醇溶液混合液的吸光度;Aj表示未加DPPH溶液的幼果多酚溶液的吸光度;A0表示未加樣品時DPPH甲醇溶液的吸光度。

具體操作方法:準確量取4.5mL 0.05mol/L,pH8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中,于25℃水浴中預熱20min,加入供試樣品液1mL,2.5mmol/L鄰苯三酚0.4mL,充分混勻后在25℃水浴中反應5min,立即用兩滴10mol/L HCI終止反應,蒸餾水調零,于325nm處測定吸光度,得A1。空白對照組以0.1mL蒸餾水代替樣品,得A0,同時作空白A2,并按下式計算清除率:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

1.2.4.4 蘋果幼果多酚對羥基自由基(·OH)的清除作用 采用金鳴[18]等建立的以自由基氧化作用為基礎的比色法測定。Fenton反應可使H2O2/Fe2+產生·OH,·OH可使鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+,使其在536mn處的強吸收消失。根據吸光度的減弱判斷樣品清除·OH的能力。量取5.0mL PBS(0.2mol/L)和5.0mL蒸餾水于試管中,作空白參比;量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL蒸餾水和1.0mL H2O2(0.01%)于試管中,作損傷;量取5.0mL PBS(0.2mol/L)、1.0mL鄰二氮菲(0.75mmol/L)、1.0mL FeSO4(0.75mmol/L)和3.0mL蒸餾水于試管中作未損傷;量取5.0mL PBS、2.0mL樣品液和3.0mL蒸餾水于試管中,作樣品參比;精密量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL樣品液和1.0mL H2O2(0.01%)于試管中。將上述試管同時置于37℃水浴中反應60min,于536nm處測定吸光值,即得A空白、A未損傷、A損傷、A樣參和A樣品,每個樣品重復測定3次。按下式計算·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A樣品-A樣參)-(A損傷-A空白)]/(A未損傷-A空參)

蘋果幼果多酚抗氧化性實驗均選用VC和BHT為陽性對照。

1.3 數據處理和統計方法

實驗結果采用“SPSS 13.0”統計軟件進行數據分析,Excel軟件制表繪圖。

2 結果與分析

2.1 蘋果幼果中多酚含量的測定

按照1.2.3所述實驗方法測定蘋果幼果中多酚含量為22.67mg/g。沒食子酸標準曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 蘋果幼果多酚抗氧化活性實驗

2.2.1 FRAP法測定蘋果幼果多酚總抗氧化能力 采用1.2.4.1的方法進行實驗,得FeSO4標準曲線,線性回歸方程為:y=3.8165x+0.0254，R2=0.9989,結果如圖2。

圖2 還原力測定標準曲線Fig.2 Standard curve of reductive power

采用FRAP法測定不同濃度梯度蘋果幼果多酚粗提物的總還原能力,結果如圖3所示,從圖中可以看出:在實驗濃度范圍內,隨著蘋果幼果多酚濃度的增加,FeSO4當量濃度也在不斷增加,即表明受試物總抗氧化能力不斷增強。幼果多酚濃度與總還原能力總體呈正相關。與陽性對照BHT相比,不同濃度蘋果幼果多酚提取物FRAP值均比其高,抗氧化能力優于BHT,且均達顯著水平(p<0.05),但二者FeSO4當量濃度均低于相應濃度陽性對照VC,且差異顯著(p<0.05)。可見,蘋果幼果多酚提取物表現出較強的總抗氧化能力。

圖3 FRAP法測定不同濃度多酚的還原力Fig.3 Reductive power of polyphenols for different concentrations by the method of FRAP

2.2.2 不同濃度蘋果幼果多酚對DPPH·的清除作用 DPPH·分析法被廣泛用于清除自由基物質性質的研究,它是一種很穩定的以氮為中心的自由基,實驗體系中存在自由基清除劑時,可與DPPH·單電子配對而使其特征吸收峰消失或減弱,表現為吸光度的增大或減小,以此評價受試物的體外自由基清除能力。采用DPPH法測定不同濃度梯度蘋果幼果多酚提取物對DPPH·清除作用,結果如圖4所示。

由圖4可知,幼果多酚提取物,VC,BHT對DPPH·均有較強的清除作用,且隨樣品濃度的增加而不斷增強。當濃度小于30μg/mL時,VC對DPPH·的清除效果優于幼果多酚提取物和BHT,且差異顯著(p<0.05)。當濃度大于50μg/mL時,VC和幼果多酚提取物的清除效果相接近,清除效果強。當濃度為90μg/mL時,幼果多酚提取物和VC的清除率分別為96.96%和97.42%,均已接近最大清除率。

圖4 不同濃度蘋果幼果多酚對DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on DPPH·

圖5 不同濃度蘋果幼果多酚對·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·

2.2.4 不同濃度蘋果幼果多酚對·OH的清除作用 實驗采用鄰二氮菲-Fe3+-H2O2法評價不同濃度梯度蘋果幼果多酚清除·OH的能力,以此反映幼果多酚抗氧化性的強弱。結果如圖6所示。

圖6 不同濃度蘋果幼果多酚對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·OH

羥基自由基(·OH)是需氧生物代謝過程中產生的具有強氧化能力的氧自由基,它被認為是毒性最強的活性氧自由基,其反應性極強,壽命極短,對機體的破壞作用最大,是造成生物有機體過氧化損傷的主要因素。由圖5可知,無論是幼果多酚受試物還是陽性對照,三者對·OH均有較強的清除作用,且隨濃度的增加,其清除作用增強。當蘋果幼果多酚濃度為90μg/mL時,其對·OH的清除率可高達82.20%,當實驗濃度大于30μg/mL時,三者對·OH的清除效果強弱順序為:VC>蘋果幼果多酚>BHT,且差異顯著(p<0.05)。

2.3 相關性分析

對蘋果幼果多酚含量與其抗氧化性作相關性分析,結果如表1所示。

表1 蘋果幼果多酚與其抗氧化性的相關系數Table 1 Correlation coefficient between polyphenol contents and antioxidant activity of unripe apple products

注:* 相關性顯著(p<0.05),** 相關性極顯著(p<0.01)。

3 結論

[1]呂霜竹,霍學喜.中國蘋果出口歐盟市場價格競爭力研究[J].華中農業大學學報:社會科學版,2013(4):56-61.

[2]苗洪亮.中國蘋果及果汁出口的市場環境分析及對策研究[D].武漢:華中農業大學,2006:1-60.

[3]Lijun Sun,Yurong Guo,Chengcheng Fu,etal. Simultaneous separation and purifycation of total polyphenols,chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples[J]. Food Chemistry,2013,136(2):1022-1029.

[4]唐傳核,彭志英. 蘋果多酚的開發與應用[J].中國食品添加劑,2001(2):41-44.

[5]Yinrong L,Yeap F L. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry,2000,68(1):81-85.

[6]Suarez B,Alvarez A L,Garcia Y D,etal. Phenolic profiles,antioxidant activity and in vitro antiviral properties of apple pomace[J]. Food Chemistry,2010,120(1):339-342.

[7]Yanggaida A,Kanda T,Tanabe M,etal. Inhibitory effects of apple polyphenols and related compounds on cariogenic factors of mutans streptococci[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(11):5666-5671.

[8]陳瑩,徐抗震,聶威,等. 蘋果生果中蘋果多酚提取工藝的優化研究[J].應用化學,2009,38(11):1582-1585.

[9]艾志錄,郭娟,王育紅,等. 微波輔助提取蘋果渣中蘋果多酚的工藝研[J].農業工程學報,2006,22(6):188-191.

[10]高曉明,呂磊,王瑞,等. 蘋果多酚的乙醇提取和大孔樹脂純化工藝研究[J].食品研究與開發,2009,30(11):21-25.

[11]牛鵬飛,仇農學,杜寅. 蘋果渣中不同極性多酚的分離及體外抗氧化活性研究[J].農業工程學報,2008,24(3):238-242.

[12]李志西,李元瑞,葛蕾,等. 蘋果渣多酚超聲波提取工藝及其抗氧化性研究[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2005,33(8):131-134.

[13]Spigno G,Tramelli L,Faveri M D D. Effects of extraction time,temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics[J]. Journal of Food Engineering,2007,81:200-208.

[14]Benzie I F F,Strain J J. The ferric reducing ability of plasma as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239:70-76.

[15]Akowuah G A,Ismail Z,Norhayati I,etal. The effects of different extraction solvents of varying polarities on polyphenols of Orthosiphon stamineus and evaluation of the free radical-scavenging activity[J]. Food Chemistry,2005,93:311-317.

[16]仇農學,王宏,李艷,等. 蘋果渣中多酚物質的體外抗氧化活性[J].浙江林學院學報,2006,23(5):527-531.

[17]吳青,黃娟,羅蘭欣,等. 5種中草藥提取物抗氧化活性的研究[J].中國食品學報,2006,6(1):284-288.

[18]Larrauri J A,Sanchez-Moreno C,Saura-Calixto F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(7):2694-2697.

Antioxidative activitiesinvitroof polyphenols from unripe apple pomace

CHEN Wei-qi,GUO Yu-rong*,ZHANG Juan,DOU Jiao,ZHANG Xiao-rui

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

unripe apple;polyphenols;antioxidant properties

2014-03-26

陳瑋琦(1989-)，女，碩士研究生，主要從事食品功能成分開發及利用方面的研究。

*通訊作者:郭玉蓉(1962-)，女，博士，教授，主要從事食品生物加工研究。

農業部現代蘋果產業技術體系建設專項基金資助(CARS-28)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.016