不同產區18種藍莓提取物抗氧化與抑菌作用研究

姜文潔,孫曉紅,*,朱 穎,楊 晗,劉曉鈺，吳啟華,潘迎捷

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;2.美國緬因大學食品與農業學院,緬因 04469)

不同產區18種藍莓提取物抗氧化與抑菌作用研究

姜文潔1,孫曉紅1,*,朱 穎1,楊 晗1,劉曉鈺1，吳啟華2,潘迎捷1

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;2.美國緬因大學食品與農業學院,緬因 04469)

本文以18種栽培藍莓的乙醇提取物為研究對象,利用體外法研究了不同產區藍莓提取物對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用及還原能力,分別采用福林酚法、亞硝酸鈉法和pH示差法測定了18種藍莓中總酚、黃酮及花青素的含量,同時利用試管二倍稀釋法測定了不同產區18種藍莓提取物對副溶血性弧菌的抑制作用。結果表明,不同產區18種藍莓對DPPH自由基及羥基自由基均具有良好的清除作用,對DPPH自由基清除率的范圍為11%～65%,對羥基自由基清除率的范圍為20%～64%,杭州產區的藍莓還原能力強于上海及青島兩個產區;不同產區18種藍莓的總酚、黃酮及花青素含量不同,總酚含量較高的藍莓具有較好的抗氧化能力;不同產區18種藍莓粗提液對副溶血性弧菌表現出不同程度的抑制作用,其MIC值最小的為15.625mg/mL,最大的為250mg/mL。由此可以得出,不同產區不同品種藍莓在功能和活性成分上存在差異。

不同產區,藍莓提取物,抗氧化,抑菌作用

藍莓(Blueberry),又稱越桔,屬于杜鵑花科越橘屬多年生常綠灌木。果實呈現深藍色,外面裹有一層白色果粉,酸甜適口,風味獨特,具有極高的營養價值。藍莓含有豐富的多酚類物質,具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、抗衰老及預防心血管疾病等多種生理活性功能[1]。自1983年我國引種藍莓以來,全國藍莓種植企業及大型種植戶不斷增加,累計約200多家,各類藍莓品種超過200個,種類繁多。

國內外很多研究者對藍莓的抗氧化能力進行過探討。周方等[2]通過對6個高叢藍莓品種的花青素含量及抗氧化能力研究發現,品種埃利奧特表現出較強的 DPPH 自由基清除能力和總還原能力,有較好的抗氧化效果。姜愛麗[3]等人對四個品種北高叢藍莓進行了抗氧化活性研究。Wang等[4]人以不同品種的兔眼藍莓為對象,研究了不同品種之間的抗氧化能力差異。關于藍莓抑菌能力方面的報道,國外比較常見。Chatterjee等[5]發現藍莓對clarithromycin有抗藥性的幽門桿菌(49503)有抑制作用,或加強其對clarithromycin的敏感性。Caillet[6]等人研究結果表明,藍莓提取物對沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等致病菌均有一定的抑制作用。目前,國內尚未有關于不同產區不同品種藍莓抗氧化和抑菌功能及其活性成分的研究。因此,本研究以我國三個地區18個不同品種藍莓作為研究對象,測定了其總酚含量、花青素含量以及黃酮成分含量,對抗氧化功能以及抑菌功能進行了探討,為藍莓栽培和開發藍莓保健食品等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛國者,藍豐,北青及尼爾森4個品種 購自青島沃林藍莓有限公司;園藍,森吐里昂,杰兔,巨豐,粉藍,頂峰,精華,梯芙藍8個品種 購自杭州貝萊特藍莓綜合開發有限公司;奧尼爾,藍豐,粉藍,燦爛,日出及H31 6個品種 購自上海金山敏藍藍莓專業合作社;實驗用三株副溶血性弧菌:ATCC33847、ATCC17802購自中國科學院微生物研究所,F36由本實驗室分離并保存,菌株于-20℃冰箱保存。

1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 購自Sigma公司;過氧化氫,硫酸亞鐵,水楊酸,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,鐵氰化鉀,三氯乙酸,三氯化鐵,無水乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,碳酸鈉,沒食子酸,蘆丁標準品,福林酚等 購自國藥集團化學試劑有限公司。

超聲清洗儀SK5200HP 上海科導超聲儀器有限公司;旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;循環水真空泵SHB-3 上海申生科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;8010s 勻漿機 Waring Commerial;隔水式恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;ESCO超凈工作臺 美國Airstream公司;Bio-Tek酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓粗提液的制備 參考謝慶超等[7]方法制備藍莓粗提液。

1.2.2 不同產區18種藍莓粗提液對DPPH·的清除作用 不同品種藍莓粗提液對DPPH·的清除作用參照Cerezo等[8]的方法進行改進。用無水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液,避光保存。具體實驗步驟按照表1進行。將反應體系充分混勻,室溫下避光靜置30min。反應結束后,在517nm處測定吸光度值。0.5mg/mL抗壞血酸作為陽性對照。

其自由基清除率按照公式(1)進行計算

式中:Sa表示DPPH自由基清除率,Ai表示實驗組,Aj表示空白實驗組,A0表示對照實驗組。

表1 DPPH·法反應體系Table 1 Method of DPPH·

1.2.3 不同產區18種藍莓粗提液對OH·的清除作用 參照Smironff等[9]的方法做改動,反應體系包括1mL H2O2(8.8mmol/L),1mL FeSO4(9mmol/L),1mL水楊酸-乙醇(9mmol/L),樣品溶液1mL,最后加入H2O2啟動整個反應,37℃條件下反應30min。由于藍莓粗提液本身具有吸光值,以1mL FeSO4(9mmol/L),1mL水楊酸-乙醇(9mmol/L),1mL樣品溶液及1mL蒸餾水作為藍莓粗提液的本底吸收值。其自由基清除率按照公式(2)進行計算。其中0.5mg/mL抗壞血酸作為陽性對照。

式中:Sa表示OH自由基清除率,A0表示空白對照的吸光度,AX表示加入樣品的吸光度,AX0表示樣品的本底吸光度。

1.2.4 還原能力實驗 參照李穎暢等[10]的方法,略做改動。取一定濃度的樣品溶液2.5mL于試管內,依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液,2.5mL 1%的鐵氰化鉀,于50℃水浴保溫20min后,快速冷卻,再加入2.5mL 10%三氯乙酸(TCA),以3000r/min離心10min,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸餾水,0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液,充分混勻,靜置10min后在700nm處測定吸光度值,吸光度越大,表示樣品的還原能力越強。以0.5mg/mL抗壞血酸作為本實驗的陽性對照。

1.2.5 總酚含量的測定 總酚含量采用Folin-Ciocalte[11]的方法進行測定,以沒食子酸作為標準物質。沒食子酸標準曲線的繪制:準確稱取沒食子酸標準品0.05g,配制成0.1mg/mL的沒食子酸標準溶液。分別移取標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于2mL離心管中,加超純水至1mL,加入0.4mL Folin-Ciocalte試劑,混合均勻后再加入0.8mL質量分數為10%的Na2CO3飽和溶液,定容至5mL,室溫下靜置2h,在770nm波長處測定吸光度。以沒食子酸的質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。樣品總酚含量的測定:準確吸取一定濃度的樣品溶液100μL,定容至1.0mL,加入0.4mL Foiln-Ciocalte試劑以及0.8mL 10% Na2CO3飽和溶液,定容至5mL,室溫下靜置2h,總酚含量表示為沒食子酸的當量,實驗重復3次。

1.2.6 黃酮含量的測定 黃酮含量采用NaNO3-AI(NO3)3的方法[12]測定,以蘆丁作為標準物質。蘆丁標準曲線的繪制:準確移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL濃度為0.11mg/mL的蘆丁標準溶液于試管中,加入60%乙醇溶液至5mL,加入0.3mL質量分數為10%的亞硝酸鈉溶液,混合均勻放置3min;再加入質量分數10%硝酸鋁溶液0.3mL,放置6min;加入8%氫氧化鈉溶液2.0mL,最后用60%乙醇定容至10mL,混勻放置15min,分別于500nm處測定吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。樣品黃酮含量的測定:吸取樣品溶液500μL,用60%乙醇定容至5mL,按照標準曲線的測定方法,加入顯色劑,在500nm處測定吸光度值。黃酮含量表示為蘆丁當量,實驗重復3次。

1.2.7 花青素含量的測定 采用pH示差法[13]進行花青素含量的測定,以矢車菊-3-葡萄糖苷為參照。取藍莓粗提液1mL,加入pH4.5的0.4mol/L的醋酸鈉緩沖液或pH1.0的0.025mol/L氯化鉀緩沖液4mL,搖勻。分別在520nm和700nm波長處測定其吸光度值。實驗重復進行3次。花青素含量按照以下公式進行計算:

式中,C為藍莓中花青素的含量,mg/L;A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD700)pH4.5;ε:摩爾吸光系數,以矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾系數進行計算,為26900;MW為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質量,為449.2g/mol;DF為稀釋因子。最終以1g試樣中含有花青素的量(mg)來表示。

1.2.8 藍莓提取液對副溶血性弧菌的抑制作用 參照呂平等[14]的方法,采用試管二倍稀釋法。取8支無菌試管,向第1至第7支試管中加入2mL TSB;在第1支試管中加入2mL藍莓提取物原液(1000mg/mL),混勻后再吸取2mL至第2支試管,如此倍比稀釋至到第6支試管,混勻后吸取2mL棄去。第7支試管為不加藍莓提取液的生長對照。第8支試管加入2mL無菌TSB和2mL藍莓提取液,混勻后棄去2mL。最終使第1支試管至第6支試管的藍莓粗提液濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625mg/mL。向7支試管中加入10μL四種菌的菌液,37℃下培養24h后,進行10倍稀釋,取合適梯度涂TCBS平板,于恒溫培養箱中培養24h,以菌落數無變化的最低藍莓提取物的濃度為MIC值,以菌落數不超過5個的最低藍莓提取物的濃度為MBC值。實驗重復進行3次。

1.2.9 數據處理 利用SPSS17.0以及Origin8.0進行數據統計分析及作圖。

2 結果與討論

2.1 不同產區18種藍莓粗提液對DPPH自由基的清除作用

由圖1可以看出,不同產區不同品種藍莓對DPPH自由基的清除作用存在差異,抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力較強,其DPPH自由基清除率遠高于其他18個品種。這可能與本實驗中藍莓的提取方法有關,本實驗以藍莓粗提液為對象,沒有進一步純化,導致其DPPH自由基清除能力與抗壞血酸差距較大。18個品種中,清除DPPH自由基能力的前三位排序為:森吐里昂>杰兔>園藍,其中森吐里昂的DPPH自由基清除率高達65.06%±0.04%,最后三位排序為尼爾森<精華<北青,尼爾森的DPPH自由基清除率僅為10.79%±0.02%。Scalzo等[15]研究表明水果的基因型不同可以導致水果的抗氧化能力不同,與本研究相符,主要是由于不同品種藍莓本身的遺傳信息不同導致它們的DPPH自由基清除能力存在差異。對于3個產區的藍莓,產于杭州種植基地的藍莓DPPH自由基清除能力比產于上海的藍莓DPPH自由基清除能力強,而青島的四個藍莓品種的DPPH自由基清除能力相對較弱。Sun等[16]對我國9種兔眼藍莓的抗氧化能力進行了研究,結果表明9種兔眼藍莓對DPPH自由基均具有清除作用,主要是由于藍莓中所含的花青素所引起的。胡可等[17]研究表明光是影響花青素苷合成最重要的環境因子之一。由于杭州藍莓種植基地是露天種植,地理位置是在山坡上,藍莓果實能夠接受充足的陽光。由此推斷,充足的陽光促進了藍莓中花青素苷的合成,因此杭州藍莓品種表現出比其它兩個地區更強的DPPH自由基清除能力。

圖1 18種藍莓粗提液對DPPH·的清除作用Fig.1 The DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical scavenging activity of eighteen cultivars of blueberry extracts

圖2 18種藍莓粗提液對羥基自由基的清除作用Fig.2 The hydroxyl radical scavenging activity of eighteen cultivars of blueberry extracts

2.2 不同產區18種藍莓粗提液對羥基自由基的清除作用

羥基自由基是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基,對細胞內DNA的破壞作用最大[18]。由圖2可以看出,不同產區不同品種藍莓清除羥基自由基的能力存在差異,抗壞血酸的羥基自由基清除率高于其他18個品種的藍莓。18個品種中,青島的愛國者清除羥基自由基的能力最強,其自由基清除率達到64.4%±0.02%,清除羥基自由的能力最差的為杭州的頂峰,清除率僅為20.2%±0.02%。對于3個產區的藍莓,青島產區的藍莓清除羥基自由基能力相對較強。

2.3 不同產區18種藍莓粗提液還原力實驗

由圖3可以得出,18種栽培藍莓的還原能力存在差異,抗壞血酸的還原能力比其他18個品種藍莓的還原能力強,大約是還原能力最強的森吐里昂品種還原能力的1.16倍。18個品種中,還原能力較強的品種有森吐里昂(杭州),愛國者(青島),巨豐(杭州),粉藍(上海),園藍(杭州);還原能力較差的品種有藍豐(青島),尼爾森(青島),奧尼爾(上海)。來自三個區域的藍莓品種,杭州藍莓品種的還原能力強于上海藍莓品種,強于青島藍莓品種。

圖3 18種藍莓粗提液還原能力的測定Fig.3 The reducing power of eighteen cultivars of blueberry extracts

2.4 不同產區18種藍莓總酚、黃酮及花青素含量

多酚、黃酮及花青素等生物活性物質具有抗氧化、抗炎癥以及抗癌等功能,對維持和促進人體健康有積極作用。有研究[19]表明藍莓總抗氧化能力與總酚含量具有良好的線性關系。由表2中可以看出,不同產區不同品種藍莓中的總酚、黃酮及花青素含量存在差異。總酚含量的范圍為0.63～2.81mg/g,含量最高的為杭州的森吐里昂,含量最低的為青島的尼爾森,含量較高的還有杭州的杰兔、園藍、巨豐等。黃酮含量在0.05～0.20mg/g之間,含量最高的為杭州的園藍及青島的尼爾森,含量最低的為杭州的梯芙藍和杰兔。花青素含量在0.06～0.68mg/g之間,杭州的森吐里昂花青素含量最高,為0.68mg/g,含量最低的為上海的燦爛。

2.5 藍莓粗提液對副溶血性弧菌的抑制作用

由表3可以看出,不同產區不同品種藍莓提取物對副溶血性弧菌均有一定的抑制作用,但抑制程度存在差異。其中抑菌效果表現突出的有杭州的粉藍、頂峰以及上海的粉藍、H31,它們對副溶血性弧菌的MIC值僅為15.625mg/mL。Vivian C.H.Wu等[20]通過研究表明美國越橘中酚醛、花青素和有機酸等成分對大腸桿菌O157∶H7均有抑制作用,且酚類物質的抑菌效果最好。Saftner等[21]的研究表明藍莓所表現出的良好品質與藍莓生長的地理位置、氣候條件以及藍莓本身的基因型有關。本文中的藍莓產于我國三個不同的地區,由于其地理位置及氣候的不同很可能導致藍莓中所含活性成分不同,例如對抑菌作用貢獻較大的酚類物質含量的不同,這就導致了18種不同藍莓粗提取液對副溶血性弧菌的抑制作用產生差異。

表2 18種藍莓總酚、黃酮及花青素的含量Table 2 The total phenolics content,total flavonoids and total anthocyanins contents of 18 blueberry cultivars

表3 18種藍莓粗提液對副溶血性弧菌的MIC值和MBC值Table 3 The MIC and MBC of 18 blueberry extracts against Vibrio parahaemolyticus

3 結論

不同產區不同品種的藍莓有不同的抗氧化活性,對DPPH自由基、羥基自由基表現出不同的清除能力,其中DPPH自由基清除率在11%～65%之間,羥基自由基清除率在20%～64%之間。DPPH自由基清除能力最強的為杭州的森吐里昂,清除率為65.06%±0.04%,清除OH自由基能力最強的為青島的愛國者,清除率為64.4%±0.02%。它們的還原能力也存在一定的差異,吸光度值在0.3～1.4之間,吸光度值越大,還原能力越強,還原能力最強的為杭州的森吐里昂。

不同產區18種藍莓中總酚含量、黃酮含量及花青素含量存在差異,酚類物質含量較高的品種對應較強的抗氧化能力。

18種藍莓粗提液對副溶血性弧菌的均有一定抑制作用,不同品種不同產區藍莓對副溶血性弧菌均表現出了抑制作用,且它們的MIC和MBC值不相同,即抑制效果不同。對副溶血性弧菌抑制作用較強的有杭州的頂峰、粉藍,MIC值僅為15.625mg/mL。

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Study on antioxidant capacities and antibacterial effects of eighteen blueberry cultivars from different areas

JIANG Wen-jie1,SUN Xiao-hong1，*,ZHU Ying1,YANG Han1,LIU Xiao-yu1,Vivian Chi-hua Wu2,PAN Ying-jie1

(1.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China;2.School of Food and Agriculture,the University of Maine,Orono,ME04469,USA)

The antioxidant capacities and antibacterial effects of 18 different blueberry cultivars from Hangzhou,Shanghai and Qingdao were investigated in this study. The antioxidant capacities of blueberry extracts were measured through free radical scavenging abilities including DPPH· and OH· free radicals and reducing power. The contents of total phenolics,flavonoids and anthocyanins were determined using Folin-Ciocalteu method,Sodium nitrite method and pH differential method respectively. The antibacterial effects of blueberry extracts against Vibrio parahaemolyticus were determined by the test tube two-fold dilution method. The results showed that 18 blueberry cultivars from three different areas showed good DPPH· and OH· free radical scavenging abilities with the range from 11%～65% and 20%～64%,respectively. The blueberry cultivars of Hangzhou showed stronger reducing power than those of the other two areas. 18 blueberry cultivars showed different antibacterial effects against Vibrio parahaemolyticus with the Minimal inhibitory concentration(MIC)and the Maximum inhibitory concentration(MBC)being of 15.625mg/mL and 250mg/mL,respectively. It can be concluded that there were differences in their function and components among different blueberry cultivars of different areas.

different areas;blueberry extracts;antioxidant capacities;antibacterial effects

2014-03-10

姜文潔(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程。

*通訊作者:孫曉紅(1978-),女，博士，副教授，研究方向：食品安全與食品微生物。

上海市科委部分地方院校能力建設項目(11310501100)；上海市教育委員會科研創新項目(11YZ159)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.017