納豆芽孢益生桿菌的篩選鑒定及耐受性、抑菌能力的研究

曾祥燕,趙良忠

(邵陽學院生物與化學工程系,湖南邵陽 422000)

納豆芽孢益生桿菌的篩選鑒定及耐受性、抑菌能力的研究

曾祥燕,趙良忠*

(邵陽學院生物與化學工程系,湖南邵陽 422000)

根據納豆芽孢桿菌的生物學特性,從不同納豆食品中篩選出具有較高纖溶活性的菌株4株,分別就它們對溫度、pH、抗生素的耐受性以及對病原菌的抑制能力和對有益菌的共生能力進行研究,結果表明:KH-1和KH-9具有良好的對溫度、pH、抗生素耐受性及對病原菌的強抑制能力和對有益菌的共生能力。

篩選,鑒定,納豆芽孢桿菌,耐受性,抑菌能力

益生菌是指具有生物活性,攝入適當量時可以對宿主產生有益作用的微生物[1]。納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是益生菌的一種,從日本的傳統發酵食品納豆中發現并分離出來的,屬于細菌科、芽孢桿菌屬,是枯草芽孢桿菌的一個亞種[2]。納豆芽孢桿菌作為美國FDA公布的40種益生菌之一,具有抗菌、促消化和提升免疫力功能,納豆激酶是納豆菌在發酵大豆時向胞外分泌的一種易溶于水的堿性蛋白質,它具有溶血栓和抗菌抑菌等作用[3]。納豆菌能促進雙歧桿菌、乳酸桿菌和梭菌等厭氧菌的生長,有效抑制腸道中腸桿菌和腸球菌等需氧菌的數量,保持宿主腸道微生態平衡。該菌對溫度耐受性越高,在日常的保存及制粒中的生存能力就越強;對pH的適應能力越強,則就越能較好地適應胃腸環境;對抗生素的適應能力越強,則就越能與抗生素進行配伍協調式的同時使用,抑制病原菌的能力越強,則對畜禽疾病的治療效果就越顯著[4]。微生態制劑是用益生菌經培養而制成的活菌制劑,產品無污染、無毒副作用,在使用時多制成該菌休眠狀態的活菌制劑[5-6]。對溫度、pH、抗生素具有良好耐受性、對病原菌有強抑制能力以及對有益菌有很好共生能力,是益生菌進入腸道后較好發揮作用的基本條件。本研究從各種豆類中篩選鑒定出納豆芽孢桿菌四株,分別就它們對溫度、pH、抗生素的耐受性進行探討,為納豆芽孢桿菌在混合微生物飼料活菌制劑的開發提供一定的技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種面包酵母、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、脂肪芽孢桿菌、紅發夫酵母、大腸桿菌等菌種來源于華南理工大學食品學院和康瑞德公司;20種不同品牌的豆豉 主要源于武漢市場、湖南邵陽市場、華南理工大學市場、五山市場和康瑞德公司,其中包括黃豆、綠豆、豌豆和納豆等,將豆豉分別標號:KH-1、KH-2、KH-3……KH-20。米糠、米粉、糊精、玉米淀粉 四種載體;米糠、米粉自制;糊精、玉米淀粉來源于廣州雙橋股份有限公司。固體培養基Ⅰ(g/L) 牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2～7.4,瓊脂20;液體培養基(g/L) 胰蛋白胨5,牛肉浸粉1,酵母浸粉2,NaCl 5,pH7.2～7.6;固體培養基Ⅱ(g/L) 胰蛋白胨5,牛肉浸粉1,酵母浸粉2,NaCl5,pH7.2～7.6,瓊脂20;LB培養基(g/L) 胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl10,pH7.0,瓊脂15;D-果糖 上海源聚生物科技有限公司;D-木糖 上海博奧生物科技有限公司;L-苯丙氨酸 上海博奧生物科技有限公司;D-甘露醇 索萊寶生物科技有限公司。

表1 不同pH溶液的配制Table 1 Confection of different pH solution

LS-2超凈工作臺 上海市滬新凈化設備廠;CS10電熱鼓風干燥箱重慶實驗設備廠制造;L05-2A低速離心機 北京醫用離心機廠;HH.S11-2電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;PYX-DHS-40X50隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;THZ THZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠;PHS-2C型酸度計 上海虹益儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種鑒定 納豆芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌屬,利用產納豆激酶這一特征可以從大量的豆豉中進行快速有目的地篩選所需的菌株,許多學者認為其與枯草芽孢桿菌十分相似,故學者們都以枯草芽孢桿菌的特征作為其鑒定指標[7],進行個體形態鏡檢和生理生化特征實驗,包括過氧化氫酶實驗、V.P實驗、發酵葡萄糖產酸實驗、酪蛋白(酪氨酸)水解實驗、明膠水解實驗、硝酸鹽還原實驗、吲哚實驗等實驗。

產過氧化氫酶實驗:從斜面挑取一環菌種置于結晶的試管內,滴加3%的過氧化氫溶液約2mL,如在半分鐘內產生氣泡者,為過氧化氫酶實驗陽性,不產生氣泡者為陰性。

V.P實驗(乙酰甲基甲醇實驗):將待鑒定的菌種接種緩沖葡萄糖蛋白胨水培養基試管中(驗證一下重現性),然后在(36±1)℃恒溫箱中培養2～4d;在上述試管中分別按培養基一半的量加入6%的α-萘酚酒精液,搖勻,再按培養液三分之一的量加入40%的氫氧化鉀液,充分搖動,觀察結果,呈現紅色者為V.P實驗陽性,不呈現紅色者,為陰性。

糖發酵實驗:配制不同糖類的水楊素發酵實驗培養基,按不同的糖類分裝試管,貼上相應的標簽,并在各試管中倒置一支杜氏小管,將上述試管置于(36±1)℃恒溫箱中培養,24、48與72h各觀察記錄一次,若觀察的實驗結果中紫色的培養基變黃者,表明產酸。

酪蛋白(酪氨酸)水解實驗:以劃線接種法將實驗菌接種于酪蛋白(酪氨酸)瓊脂培養基上,然后置于37℃的恒溫箱中培養1～2d,觀察結果,平板中菌落周圍有透明圈者,為酪蛋白(酪氨酸)分解實驗陽性,反之為陰性。

明膠的水解實驗:取含明膠培養基的試管兩支,一支針刺接種實驗菌于明膠培養基中,另一支作為空白對照,37℃培養5d,然后取出,置冰箱中20min,若空白實驗管凝固,而接種有實驗菌的管內明膠培養基仍為流體,則表明其可以液化水解明膠。

硝酸鹽還原實驗:將配制好的硝酸鹽培養基分裝于試管中,接入菌種,連同空白培養基一起置于37℃培養1～4d,在空白管中一次加入2%的淀粉溶液3滴,6mol/L HCl 5滴,5%的碘化鉀2滴,搖勻,若顏色變藍,表明培養基中混有亞硝酸鹽,應該重新配制培養基進行實驗,若顏色沒有變藍,表明培養基合格;繼續按上述的滴加對發酵液進行實驗,若顏色變藍,表明硝酸鹽被還原,為陽性,反之為陰性。

吲哚實驗:將測試菌接種于蛋白胨水培養基中,37℃培養1～2d,必要時培養4～5d;取培養好的試管,加入約0.5mL的乙醚,振搖均勻后,靜置分層,再沿管壁加入約0.5mL的吲哚試劑,陽性者試劑層呈玫瑰紅色,否則為陰性。

1.2.2 耐受性和抑菌效果的實驗 分別就它們對溫度、pH、抗生素的耐受性以及對病原菌的抑制能力和對有益菌的共生能力進行研究,方法如下[8-9]。

1.2.2.1 納豆芽孢桿菌對溫度的耐受性 用同樣的液體培養基將鑒定所得的菌株培養60h后3500r/min離心30min,取用發酵上清液1mL,其稀釋至一定的倍數,于93、98℃水中保溫5、10、15、20min,然后冷卻,以室溫下未經水浴的菌株對照,采用平板計數法計算存活率,據此判斷其對溫度的耐受性。

1.2.2.2 納豆芽孢桿菌對pH的耐受性 配制兩種不同的pH緩沖液,取不同的量配成不同pH的溶液,配制方法見表1,其中:A液為0.1mol/L的檸檬酸溶液,B液為0.2mol/L的磷酸氫二鈉。

將菌株采用同樣的液體培養基培養60h后3500r/min離心30min,取用發酵上清液1mL分別加入10mL對應的無菌緩沖液中,涂布平板計數,計算相對存活率,以此判斷其pH的耐受性。

相對存活率(%)=pH處理后的每組實驗組存活平均菌數/Max(pH處理后的每實驗組存活平均菌數

1.2.2.3 納豆芽孢桿菌對抗生素的耐受性 采用阿散酸、土霉素、抗敵素等幾種抗生素及推薦劑量進行實驗。用直徑為6mm的圓形紙片,浸入對應的抗生素溶液中,浸泡2h,取出后陰干備用。

將菌體培養60h后,與固體培養基混勻,保持菌數在109～1010cfu/mL之間,取15mL液體倒入平板,待分散均勻干固后,將無菌的紙片放入平板上培養24h后測定抑菌圈的大小。

表2 纖溶活性Table 2 Fibrinolysis activity

1.2.2.4 納豆芽孢桿菌的抑菌效果 將待實驗的菌種和納豆芽孢桿菌培養48～60h,然后對納豆發酵液進行離心分離,用實驗菌種涂板后貼上直徑6mm的紙片,然后涂上10μL的納豆上清液于紙片上點,在37℃恒溫下培養24～48h,測量抑菌圈[10-12]。

1.3 數據處理與分析

采用excel繪圖和制表,用SPSS進行因素方差分析,數據以平均值±標準差表示,結果p<0.01為極顯著,p<0.05為顯著,p>0.05為不顯著。

2 結果與討論

2.1 纖溶活性

纖溶活性是許多納豆芽孢桿菌具有的特性,同時這種纖溶活性也有助于益生菌在畜禽腸道內發揮好的作用,基于這種原因對20個平皿的菌株進行篩選,實驗結果見表2。從上述平皿中挑取KH-1、KH-4、KH-7、KH-9、KH-10、KH-14、KH-17單菌落各3株接種于試管斜面,培養24h后置于4℃的冰箱保存,選擇以纖溶活性強的菌株進行進一步的鑒定實驗。

2.2 生理生化特性

以枯草芽孢桿菌為對照,各項具體指標結果見表3。

菌株的纖溶活性越強,則其為納豆芽孢桿菌的幾率也越大,為了盡快鑒定出所需菌種,本實驗采用了單項和多項逐一淘汰法,在鑒定的過程中,待鑒定菌株如有兩項以上不符合鑒定的標準,即予以淘汰,而不再進行下面進一步的鑒定實驗。經過纖溶活性和生理生化特性實驗初步篩選和鑒定,得到了KH-1、KH-4、KH-9和KH-14的菌株初步鑒定為納豆芽孢桿菌,分別就它們對溫度、pH、抗生素的耐受性進行進一步的探討實驗。

2.3 納豆芽孢桿菌對溫度的耐受性

益生菌菌株在制粒的過程中經常瞬時高溫,菌株對溫度的耐受性越強,菌株的活性保存時間越長,越不容易受溫度影響而死亡。實驗選用了93℃和98℃兩溫度下進行了實驗,結果如表4。實驗表明:四種菌株的存活率受溫度的影響很大。在93℃和98℃的條件下,同樣的處理5min,同一菌株之間的存活率相差達40%左右;隨著處理時間的延長,兩者之間存活率的差值縮小,處理10min后,二者的存活率差值約15%左右,當處理時間達到20min時,四種菌株除KH-9還有0.5%的存活率外,其余的全部被殺死。

同時,由表4可知,除KH-14對溫度的耐受性差一些外,其余的三種菌株相差不是很大。總體而言,在高溫下,處理的時間如不是很長,各菌株還是會有很高的存活率,在93℃處理5min,它們仍還具有90%的存活率,能夠承受飼料制粒過程中80～100℃的瞬時高溫膨化,這四種菌株對溫度的耐受性相較很強。

2.4 納豆芽孢桿菌對pH的耐受性

一般動物腸道的pH多為酸性,在pH2～3及pH5～7兩個范圍,納豆芽孢桿菌對pH的耐受性越強,它進入動物腸道后增殖和發揮作用的效果就越好,另外,在菌劑生產使用過程中,也常常會遇到不同的pH,因此,對pH有較強的適應性是發揮良好作用的前提條件。四種菌株對pH的耐受性見表5。

由表5可以看出,四種桿菌在pH7.10的環境中,存活率達95%以上;在pH5.10～7.10的范圍內,存活率都可以達到75%以上,存活率很高;在pH2.10～5.10的范圍內,pH對四種菌株的存活率影響較大,在pH2.10～3.20時,活菌株的損失率過半;四種桿菌在中性環境下,存活率最高,隨著pH的下降或升高,存活率越來越低,對四種菌株pH的耐受性進行比較的結果是KH-14最差,KH-1的耐受性最好。由表5的數據結果,通過SPSS進行分析,四種桿菌在不同的pH中存在顯著性差異(p<0.05)。

2.5 納豆芽孢桿菌對抗生素的耐受性

納豆芽孢桿菌對抗生素耐受性的結果見表6,抑菌圈直徑越小,表明該桿菌對特定的抗生素耐受性越好。根據紙片法藥敏判定標準,抑菌圈直徑0mm為不敏,0～10mm為低敏,10～15mm為中敏,大于15mm為高敏。根據該看法,對抗生素的耐受性實驗表明:四種菌株除了對球克表現為中敏度外,其余基本上都表現為低敏度,但相對而言,KH-1對實驗用抗生素的耐受性最好,除對球克低敏外,其余的都表現為不敏,KH-1對抗生素有最好的配伍性能。

表3 納豆芽孢桿菌的鑒定Table 3 Identification of bacillus subtilis natto

注:-,90%以上的菌株是陰性;+,90%的菌株是陽性;D,11～89%的菌株是陽性。

表4 a、b、c納豆芽孢桿菌存活率與溫度的關系Table 4 Relation of bacillus subtilis natto’s livability to temperatures

表5 納豆芽孢桿菌存活率與pH的關系Table 5 Relation of bacillus subtilis natto’s livability to pH values

表6 納豆芽孢桿菌對抗生素耐受性Table 6 Endured ability test of bacillus subtilis natto to antibiotic

表7 納豆芽孢桿菌的抑菌效果Table 7 Restrain effect of bacillus subtilis natto on other strains

注:-代表無抑菌圈。

2.6 納豆芽孢桿菌的抑菌效果

一般而言,動物腸道內含有大量的菌群,其中有些是對畜禽有益的,而有些是對畜禽有害的,本實驗的目的在于通過比較四種菌株對所選用細菌群的抑制能力大小,從中選出對有害菌抑制能力強,對有益菌生長的抑制能力盡可能小的菌株,這樣將有益于腸道內有益菌群的增生和有害細菌的抑制,起到防治畜禽疾病和促進生長等方面的功效。納豆芽孢桿菌對菌群的抑制能力的結果見表7。

四種菌株對其它菌的抑菌實驗結果表明:四種菌株對臘樣芽孢桿菌DM423、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌三種益生菌沒有抑制性,KH-14對脂肪芽孢桿菌有一定的抑制性,KH-9對黑曲霉沒有抑制性,四種菌對沙門氏寒菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑制性,此外,四種菌對面包酵母和啤酒酵母有較強的抑制性。四種菌株與其它的益生菌能夠共生,并對有些致病菌有較強的抑菌效果。對比四菌株,KH-1和KH-9對有益菌的抑制相對較小,而對有害菌的抑制性則較大。

3 結論

通過對溫度、pH、抗生素的耐受性以及對病原菌的抑制能力和對有益菌的共生能力進行研究,得出如下結論:KH-1和KH-9相較KH-4和KH-14而言,前二者具有良好的對溫度、pH、抗生素耐受性及對病原菌的強抑制能力和對有益菌的共生能力;KH-4對pH的耐受性較差,在動物腸道內(pH2～3),菌株的存活率較低,損失較大;而KH-14對溫度和pH的耐受性都較差。綜合比較各種菌株的特性,KH-9和KH-1對溫度、pH、抗生素耐受性及對病原菌的強抑制能力和對有益菌的共生能力較強。

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Study on screening and identification,endured abilities and restraining the nocuous abilities ofbacillussubtilinatto

ZENG Xiang-yan,ZHAO Liang-zhong*

(Department of Biology and Chemical Engineering,Shaoyang University,Shaoyang 422000,China)

Fourbacillussubtilisnattoes screened out from different natto food were researched according to the Baeterium’s properties. There are essential conditions for probiotics to exert excellent function in digestive system,for instant having the higher endured abilities to temperature,pH and antibiotic,restraining the nocuous strains’ growth and coexistenting grow with probiotic. Results showed KH-1 and KH-9 not only had good endured abilities to temperature,pH,antibiotic,but also had good abilities to restrain the nocuous strains’ growth and to coexistent grow with probiotic.

screening;identification;bacillussubtilinattoes;endured abilities;restraining the nocuous

2014-03-28

曾祥燕(1974-)，男，副教授，碩士，主要研究方向：食品生物技術。

*通訊作者:趙良忠(1962-)，男，碩士，教授，研究方向：果蔬加工。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.025